2019 Fiscal Year Research-status Report
非アルコール性脂肪性肝炎に基づく肝発癌における概日時計の影響
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18K07913
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
佐々木 茂 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (10305229)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿久津 典之 札幌医科大学, 医学部, 助教 (50531191)
仲瀬 裕志 札幌医科大学, 医学部, 教授 (60362498)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 時計遺伝子 / 肝癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）正常ヒト肝細胞およびヒト肝癌細胞株における時計遺伝子の発現とサイトカインに対する反応に関する検討
① 正常ヒト肝細胞および各種ヒト肝癌細胞株（HuH6, HuH7, HepG2, HLE, HLF, PLC-PRF-5, Hep3B）を用いて、種々の時計遺伝子（Bmal1、Rev-erb alfa、Reverb beta、Per1、Per2、Cry1）の発現を、それぞれ、qPCR法を用いて検討した。その結果、正常ヒト肝細胞および、いくつかのヒト肝がん細胞株においてもそれぞれの時計遺伝子の発現を認めた。一方、western blotting法においても同様に、正常ヒト肝細胞および種々のヒト肝がん細胞株にそれぞれの時計遺伝子の発現を確認した。しかしながらその多寡について様々な結果であり、さらにヒト肝癌細胞株を増やして、いずれも再検討を行っている。② 正常ヒト肝細胞に対して種々の炎症性サイトカイン(TNF-alfa, IL-1beta, IL-17, IL-10, IL-13)の添加によって生じる時計遺伝子の変化を明らかにするため、qPCR法を用いて検討を行った。特に、IL-10、IL-1betaの投与によっていくつかの時計遺伝子の発現に変化を認めた。特にBmal1およびPer1、Per2における発現増加が認められた。
２）C57/BL6Jマウスにおける概日時計の変化と腸内細菌叢および肝組織の変化について
①上記１）②の種々の炎症性サイトカインの添加によって生じるヒト正常肝細胞における発現を検出できたBmal1およびPer1、Per2に関して、マウス肝組織におけるこれらの時計遺伝子の発現について検討を行った。いずれも発現の多寡はあるものの、発現は確認できた。②C57/BL6Jマウスにおける腸内細菌叢プロファイルを16S rRNA gene sequence法を用いて検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
これまで、各種ヒト肝癌細胞株（HuH6, HuH7m HepG2, HLE, HLF, PLC-PRF-5, Hep3B）および正常ヒト肝細胞を用いて、種々の時計遺伝子（Bmal1、Rev-erb alfa、Rev-erb beta、Per1、Per2、Cry1）の発現をそれぞれ、qPCR法およびwestern blotting法を用いて検討してきたが、特に後者のwestern blotting法において発現の検出を明らかにするために多くの時間を要していた。また、それぞれの細胞株におけるそれぞれの時計遺伝子の発現の多寡の差が大きく、再現性を確認するために時間を要した。これらの基礎的な段階での実験に予想より大幅に時間を要してしまったことが研究全体の遅滞の原因と考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在まで主に行ってきたin vitro実験であるqPCR法およびwestern blotting法を用いる各種時計遺伝子の発現の検討は、ほぼ安定した結果を得られるようになっており、高い確実性をもって、次の検討に進める状況となった。現在、次の検討に移り、C57/BL6Jマウスにおける概日時計の変化と腸内細菌叢および肝組織の変化についての検討に進んできている。今後、さらに、Nlrp3-/- C57/BL6Jマウスを用いた検討に進み、今後は主にマウスを使用したin vivo実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
これまで、in vitro実験に多くの時間を費やしたため、研究全体の進行の遅滞が生じ、マウスを用いた実験の導入が遅くなった。このため、助成金使用予定の内訳で高額となっているマウス購入費の使用が滞り、助成金の使用が予定より大きく遅滞し、次年度使用額が生じた。
これまでの研究進捗の遅滞の主な原因となったin vitro実験、すなわち、各種ヒト肝癌細胞株および正常ヒト肝細胞における種々の時計遺伝子の発現に関する検討、さらに、正常ヒト肝細胞に対して種々の炎症性サイトカインの添加によって生じる時計遺伝子の変化に関する検討について、現在までにほぼ終了してきている。現在、次の検討に移り、C57/BL6Jマウスにおける概日時計の変化と腸内細菌叢および肝組織の変化についての検討に進んできている。
このような研究の進捗状況から、次年度にはC57/BL6Jマウスの他に、Nlrp3-/- C57/BL6Jマウスといった主にマウスを使用したin vivo実験を行う予定であり、次年度早々には助成金の使用の進捗が大きく進み、次年度使用額に翌年度分として今回請求させていただいた助成金とを合わせて全て使用させていただく計画である。
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