2018 Fiscal Year Research-status Report
肝前駆細胞と肝間葉系細胞との相互作用機構の解明と抗線維化療法標的分子の探索
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18K07964
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
東 正新 (陳正新) 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (10376783)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柿沼 晴 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座准教授 (30372444)
朝比奈 靖浩 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 寄附講座教授 (00422692)
渡辺 守 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (10175127)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞間相互作用 / 肝星細胞 / 胆管細胞 / ヒトiPS細胞 / 肝幹/前駆細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らは、これまでに確立してきた肝幹・前駆細胞及び肝線維化研究の学術・技術基盤をもとに、1. 細胞表面抗原によって高度に濃縮したマウス肝幹・前駆細胞とマウス肝間葉系細胞（星細胞）との新規共培養系を樹立することにより、肝間葉系細胞が肝幹・前駆細胞の分化・増殖に及ぼす効果と、その際に中心的な機能を有する標的分子を同定すること、2. 肝前駆細胞誘導動物モデルを用いて、肝間葉系細胞と肝幹・前駆細胞との相互作用、ならびに肝星細胞の活性化・増殖を調節しうる分子機構を探索、解析すること、3. 得られた標的分子の機能について、ヒトiPS細胞培養系を用いて肝前駆細胞と肝間葉系細胞の分化・増殖を調節しうる標的分子の機能を検証すること、の３点を目的とした研究を行い、今年度の成果として下記を得た。
マウス肝幹・前駆細胞とマウス肝間葉系細胞との新規共培養系を樹立し、マウス肝間葉系細胞由来の液性因子がマウス肝幹・前駆細胞による胆管構造の構築に促進的に機能することを明らかにした。さらに、この機能がMMP14の機能欠損によって低下すること、その際には特定のpeptideの分泌が低下していることを明らかにした（第25回肝細胞研究会にて発表）。現在さらにその機能の詳細について解明すべく、研究を進行している。
ヒトiPS細胞培養系を用いた、肝星細胞の機能検証としてヒトiPS細胞に人工的に遺伝子発現を調節できる技術を用いて、ヒトiPS由来肝星細胞にLHX2遺伝子を発現させた。LHX2遺伝子を強く発現させたヒトiPS由来肝星細胞は、肝前駆細胞のアルブミン発現を100倍以上に上昇させるなど肝前駆細胞の成熟化を強く促進した。LHX2遺伝子はヒトiPS細胞由来肝星細胞から、ラミニンなどの細胞外基質産生を調節し、細胞に適切な足場を提供して成熟化に寄与していることが示された（Sci Rep, 2019）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１の「細胞表面抗原によって高度に濃縮したマウス肝幹・前駆細胞とマウス肝間葉系細胞（星細胞）との新規共培養系を樹立することにより、肝間葉系細胞が肝幹・前駆細胞の分化・増殖に及ぼす効果と、その際に中心的な機能を有する標的分子を同定する」に関しては、非常に順調に進行している。肝幹・前駆細胞から胆管系譜細胞により嚢胞型培養体<cholangiocytic cysts>を形成させる培養系において、胎生期肝間葉系細胞と共培養すると、CK19とGrhl2発現を高めて胆管分化とtight junction形成を支持しつつ、AQP1など胆管上皮に発現するチャネル分子の発現を亢進せしめることを見いだした。Matrix Metalloproteinase (MMP)-14欠損マウス由来の肝間葉系細胞と共培養すると、野生型よりも有意に効果が少なく、増大効果はほぼ消失することを確認した。この形質の差異は非接着培養であるため肝間葉系細胞が産生する液性因子の欠如によるもので、特定のペプチド分泌に起因することも確認できており、その結果を現在、分子生物学的に確認している。
２の肝前駆細胞誘導動物モデルを用いて、肝間葉系細胞と肝幹・前駆細胞との相互作用、ならびに肝星細胞の活性化・増殖を調節しうる分子機構を探索、解析する、についても１で得られている標的ペプチドの効果を検証しているところであり、現時点で有望な結果が得られている。
３のヒトiPS細胞培養系を用いた検証に関してもLHX2遺伝子を強く発現させたヒトiPS由来肝星細胞は、肝前駆細胞のアルブミン発現を100倍以上に上昇させるなど肝前駆細胞の成熟化をさらに強く促進することが示され、ラミニンなどの細胞外基質産生を調節し、細胞に適切な足場を提供して成熟化に寄与していることが明らかになるなど、非常に順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
いずれの項目に関しても、今年度の成果に基づいて、研究を進捗させてゆく予定である。
１については、分子生物学的な検証作業として阻害薬あるいは受容体拮抗剤による検討、ウイルスベクターによるshRNAまたはcDNA強制発現の双方から、変動分子が重要な機能を有するかを検証する。これらの研究手法は、研究グループで既に十分に習熟しており、基盤となるpreliminary dataもあるため、計画は順調に進むことが期待できる。
２についてはDDC投与モデルを用いた肝前駆細胞誘導を行い、ここに１で得られた標的分子の効果を検証しているところであり、今後の解析により、方向性を確認しながら進行させてゆく予定である。間葉系細胞（星細胞・Myofibroblasts）をFACSにより分取し、得られた細胞についてwhole transcriptome解析を行うことで、変動分子を抽出することも計画している。
３については、ヒトiPS由来肝前駆細胞とヒトiPS由来肝間葉系細胞を、１と同じ非接触的に共培養し、同定した標的分子の過剰発現・阻害もしくは欠損株樹立を行い、マウスで同定された機構がヒト間葉系細胞においても同じ機能を呈しうるかを検証する。さらに、得られた知見が、肝生検組織・患者血清でも同じ動態を呈するのか検証する。
これらの研究の進展により、将来的に自己由来ヒトiPS由来細胞を用いた肝幹・前駆細胞及び成熟肝細胞へのより安定した成熟化誘導法の開発にむけた基盤技術となることを企図している。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由： 試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため、廉価な物品を選択して購入したため。
使用計画：検討する数・種類を拡大して解析を発展させて行うため、当初の計画よりも試薬を増量して購入する予定である。
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[Journal Article] Loss of fibrocystin promotes interleukin-8-dependent proliferation and CTGF production of biliary epithelium2019
Author(s)
Tsunoda T, Kakinuma S, Miyoshi M, Kamiya A, Kaneko S, Sato A, Tsuchiya J, Nitta S, Kawai-Kitahata F, Murakawa M, Itsui Y, Nakagawa M, Azuma S, Sogo T, Komatsu H, Mukouchi R, Inui A, Fujisawa T, Nakauchi H, Asahina Y, Watanabe M.
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Journal Title
Journal of Hepatology
Volume: 71
Pages: 143～152
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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