2019 Fiscal Year Research-status Report
二種類の骨髄由来肝臓修復細胞による効率的な肝臓再生療法の開発
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18K08005
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
山本 直樹 山口大学, 教育・学生支援機構, 准教授 (90448283)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
谷 健二 山口大学, 共同獣医学部, 教授 (00365420)
藤澤 浩一 山口大学, 医学部, 助教 (00448284)
高見 太郎 山口大学, 医学部, 講師 (60511251)
松本 俊彦 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (70634723)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 再生医療 / 骨髄細胞 / 電子顕微鏡 / 培養骨髄細胞 / 肝硬変 / Adenylate kinase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
GFPTGマウス全骨髄細胞からMSCを分離(Veritas Easy step kit ST19771を使用)継代し培養GFP陽性骨髄由来間葉系細胞(MSC)を確立させ、GFP/CCl4モデルの解析protocolと同様に持続肝障害(CCl4)モデルにPassage1～4までのそれぞれの培養細胞群を尾静脈から投与し、肝組織を摘出しGFP/CCl4モデルでの全骨髄細胞投与の場合と比較を開始,肝組織でのSirius Red染色での肝線維化評価では全骨髄細胞投与の場合の方が肝線維化抑制効果を認めた。
全骨髄細胞投与のGFP/CCl4モデルを作成し、骨髄細胞投与後の肝組織を浮遊切片法による高感度免疫電顕法とFEI社製の透過型電子顕微鏡Tecnai12BTと走査型電子顕微鏡Qunta3D FEG Dual Beamシステムを用いて二種類の骨髄由来肝臓修復細胞である核N/C比の高い小型細胞と類円形の大型細胞の形態学的変化を解析し、トモグラフィーによる微細構造と３Ｄ立体構造構築による解析で核N/C比の高いEpCAM陽性細胞群・CXCR4陽性細胞群と類円形のMMP9陽性細胞群の特徴解析を継続して行っている。
また我々が開発したMMP9発現細胞標識トランスジェニック(MMP9/LacZ-DsRed Tg)マウスと肝脂肪化悪化モデル(AK4KOマウス)を増殖させ、CCl4による肝線維化合併モデルを開始し、肝線維化環境下でAK4のノックアウト状態での肝細胞や星細胞等の変化を電子顕微鏡等で評価を開始し、MMP9発現増加している細胞の同定の観察を行っている。またLDLRKOマウスと新規に世界初として開発したAK5ノックアウトマウスを作成しており、現在増加させており、増加後にGFPTGマウス全骨髄細胞あるいはGFP陽性骨髄由来間葉系細胞(MSC)を投与して、肝臓内での細胞動態と機能解析を行っていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
免疫電顕による様々な抗体発現解析・培養・非培養の骨髄細胞による肝臓組織解析や各種遺伝子改変マウスを使用した環境による投与骨髄細胞の動態の解析等経過時間が多い動物実験解析がメインのため、解析・結果・再現を得るのに時間がかかっているが、実験は計画に沿って行われている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後肝線維化モデル(GFP/CCL４モデル)を利用して、さらに投与した培養・非培養骨髄細胞の特徴・相違点の解析を免疫電顕等で解析を行っていきながら、AK4 あるいはAK5 ノックアウトマウスやMMP9発現細胞標識トランスジェニックマウスとのかけ合わせによる肝臓内での投与骨髄細胞の動態や機能解析やLDLレセプターノックアウトマウス等様々な遺伝子改変マウスを利用して遺伝子欠乏環境下における投与骨髄細胞がどのような動態を示すか、どのような機能や肝臓環境改善効果を示すか、等の解析を行っていく。
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| Causes of Carryover |
培養・非培養の骨髄細胞による肝組織解析・免疫電顕による様々な抗体発現解析や各種遺伝子改変マウスを使用した環境による投与骨髄細胞の動態の解析等動物実験解析がメインのため、解析・結果評価・再現の確認に時間がかかるため。
今後肝線維化モデル(GFP/CCL４モデル)解析方法を利用して、投与した培養・非培養骨髄細胞の特徴・相違点の解析を免疫電顕等で解析を行っていきながら、AK4 あるいはAK5 ノックアウトマウスやMMP9発現細胞標識トランスジェニックマウスとのかけ合わせによる肝臓内での投与骨髄細胞の動態や機能解析やLDLRノックアウトマウス等様々な遺伝子改変マウスを利用して遺伝子欠乏環境下における投与骨髄細胞がどのような動態を示すか、どのような機能や肝臓環境改善効果を示すか、等の解析を行っていく事に使用する。
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[Journal Article] Liver regeneration therapy through the hepatic artery-infusion of cultured bone marrow cells in a canine liver fibrosis model.2019
Author(s)
Nishimura T, Takami T, Sasaki R, Aibe Y, Matsuda T, Fujisawa K, Matsumoto T, Yamamoto N, Tani K, Taura Y, Sakaida I.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 14(1)
Pages: 234-244
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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