2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism of cellular competition mediated by autophagy-related proteins
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18K08016
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
山科 俊平 順天堂大学, 医学部, 准教授 (30338412)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
稲見 義宏 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70445500)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細胞競合 / 癌治療 / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①細胞競合における弱者と強者をわける細胞間コミュニケーションのメカニズムの解明
JHH5（p62蓄積性肝癌細胞）細胞株とp62欠損JHH5細胞株、Huh-1（p62蓄積性肝癌細胞）細胞株とp62欠損Huh-1細胞株より蛋白を抽出し、電気泳動後、銀染色を行ったところ、p62発現有無によって蛋白発現が変化することがわかった。そこで2次元電気泳動による発現蛋白の解析を行っている。現時点で、p62蛋白発現の有無によって、発現が変化する複数個の蛋白の存在が確認されている。p62蛋白発現の有無によって発現が変化する蛋白が何であるかをMS解析によって同定中である。一方、一部のリソソーム蛋白分解酵素カテプシンを欠損させることによりオートファジー機能を保ちつつp62発現を亢進することが可能なカテプシンＬ欠損マウスを用いた検証ではnrf2-Notchシグナル活性化を介した機序で肝再生亢進が誘導されることを明らかとした。細胞競合で強者となる細胞では弱者細胞に対し細胞増殖が優位に立っていることが報告されているのでp62有無によって誘導される細胞競合現象でもNotchシグナルが重要である可能性が示唆された。
②時限式強者細胞株を用いたp62蓄積癌細胞に対する新規治療法の開発
ドキシサイクリン（DOX）プロモーターカスパーゼ７発現プラスミド（DOX-Caspase7）をp62欠損細胞に遺伝子導入し、ドキシサイクリン添加によって細胞死を誘導する時限式強者細胞株を樹立中である。Huh-1細胞株に関してはDOX-Caspase7プラスミド導入p62-/-Huh-1細胞を樹立したが、JHH5細胞に関しては細胞増殖が遅いため時間がかかっている。
現在樹立しているDOX-Caspase7プラスミド導入p62-/-Huh-1細胞に関しては、DOX添加によって、細胞死がどの程度誘導されるのかを再検証中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現時点までにp62発現変化によって細胞株における蛋白発現が大きく変化することを明らかにすることができた。蛋白解析も順調に進展しているのでおおむね順調と考えている。また一番時間がかかると想定していたDOX-Caspase7プラスミド導入細胞株の樹立に関しても2個のうち1つは完成しつつあるので、細胞死誘導などの検証はまだ残っているが最低限の細胞移植解析などが可能な状況となってきているので、こちらもおおむね順調と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
p62蛋白発現の有無によって発現が変化する蛋白が何であるかをMS解析によって同定する。また異なった細胞株間で共通したp62発現変化によって発現変化をきたす蛋白を同定する予定である。細胞競合に関連する蛋白が同定されたところで、蛍光免疫染色によって細胞内の蛋白局在を明らかとし、これらの蛋白の細胞内動態や作用に関して検証を行う。現在、全蛋白の解析をまず行っているが、細胞膜上に存在すると想定している細胞の強者・弱者を認識する蛋白の同定が可能でなかった場合には、細胞膜蛋白のみを単離しての解析を再度行う必要があると考えている。p62-/-JHH5細胞に関してもDOX-Caspase7プラスミド導入細胞株を樹立するとともに、樹立したDOX-Caspase7プラスミド導入p62-/-Huh-1細胞に関しては、DOX添加によって、細胞死がどの程度誘導されるのか、naive Huh-1細胞を駆逐後にDOX-Caspase7プラスミド導入p62-/-Huh-1細胞を死滅させin vitro抗癌治療が可能であるかを検証する予定である。
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| Causes of Carryover |
p62発現変化によって生じる細胞内蛋白発現変化の解析は細胞の全蛋白解析を主体に行った。昨年度予定していた糖鎖解析は解析プロトコール、解析チップ、試薬の入手に時間がかかってしまったため次年度に持ち越しとなっている。今年度、JHH5（p62蓄積性肝癌細胞）細胞株とp62欠損JHH5細胞株、Huh-1（p62蓄積性肝癌細胞）細胞株とp62欠損Huh-1細胞株より糖鎖を抽出し、p62発現変化によって生じる発現糖鎖（N型糖鎖、O型糖鎖、糖脂質）の変化について、グライコブロッティング法を用いて解析を行う予定である。
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