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2019 Fiscal Year Research-status Report

Study of sugar chains binding to BNP precursors; 1. Structure analysis, 2. Molecular mechanism, 3. relationship with heart failure condition

Research Project

Project/Area Number 18K08103
Research InstitutionKyoto University

Principal Investigator

錦見 俊雄  京都大学, 医学研究科, 非常勤講師 (80291946)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 中川 靖章  京都大学, 医学研究科, 助教 (70452357)
Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
KeywordsproBNP / BNP / 糖鎖修飾 / 精製 / ゲル濾過 / 心不全 / 質量分析装置
Outline of Annual Research Achievements

proBNPに結合する糖鎖を質量分析で解析するには一定量以上の精製物が必要である。最近申請者はBNP濃度が35000pg/mL以上を有する症例を経験し、BNP高値の機序を解析するとproBNPのN端部分に自己抗体のIgGが結合し、分子量16万を超える大分子を形成し、そのため代謝を受けずに血液中に蓄積し、世界で最初のmacro-proBNP血症として報告した(Clin Chem2018)。この患者の血漿からプロテインGカラムを用いてIgG-proBNP成分を抽出し、凍結乾燥後、pH3の酸性緩衝液に溶解、IgGを外してゲル濾過HPLC分析法を行った。proBNPの溶出するfractionをさらにミニ透析、ミニゲル濾過で数回精製し、最終生成物を高感度のイオントラップ型LC/MS質量分析装置で糖鎖の同定を試みたが、糖鎖構造解析にいたらなかった。この理由として精製の途中でIgGを外す為に、pH3の酸性緩衝液に溶解後、高濃度のNaリン酸緩衝液を用いてすぐに中和する(すぐに中和しないと糖鎖構造に影響する)が高濃度塩が産生することになり、これを完全に除ききれなかった事が一因と考えられた。またミニ透析、ミニゲル濾過を数回行ったが、膜への吸着等により、回収率が予想より低下したのも最終精製量の低下につつながったと考えられた。そこで生じた塩をC18カラムを用いて除く事とした。C18カラムに結合したproBNP、NT-proBNPを何%のアセトニトリル濃度で回収すれば最も効率が良いかをrecombinant proBNPを用いて予備的に検討した。アセトニトリル35%が回収率も85%と高く、不純物も少なく、精製度も高いと考えられた。現在、macro-proBNP患者の血漿を用いて、精製を行っているところである。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

macro-proBNP血症の患者さんから血液を提供頂き、IgG trapカラム、ゲル濾過、透析を経て、LC/MS質量分析装置で糖鎖の同定を試みたが、この精製 過程で思わぬ事が起こったため、精製出来たproBNP量が少なく、LC/MS質量分析装置での解析が不十分な結果になった。1つはIgGを外すためにプロテインGカラ ムにpH3にしたバッファーで溶出し、ゲル濾過にかけたが、applyする液量が多かったので、数回に分ける必要があった。1回の時間が洗いを含めて2時間弱かかるためovernightしたがゲル濾過後各分画のBNPの測定では、それまで見られていたシャープなピークは見られず、ピークは遅れて鈍くなり、BNPの免疫活性もブ ロードになっていた。pH3で留置しておくとシアル酸が化学変化を起こす事があることが文献で調べて判明した。もう一つの理由は、最後に数回のミニ透析を行い精製するが、回収率が少なかったことによる。今回はリン酸緩衝液ですぐに中和する事、塩の除去にC18カラムを用いる事で、酸による変性もなくなり、塩の除去もほぼ完全に出来、回収率も高くなると考えられ、現在患者血漿の精製を行っている。臨床研究では,我々が現行のproBNP測定系はproBNPを60-70%交差する事を示してきたので、糖化したproBNPを含んだStdを用いる事で(従来は BNP-32のみをStdとして使用)、種々のBNP測定系のcalibratorとして有用である事を示した。急性心不全で入院時のproANPはBNP、NT-proBNPよりも予後を示す指標として有用である事を示した。また急性心不全で入院中にNT-proBNP/mature BNP比率が大きくなる患者では将来の腎機能が悪化を予知することを示した。

Strategy for Future Research Activity

これまでの糖化proBNPの精製過程で幾つかの問題点が、精製を妨げている事が明らかとなってきた。1つは酸性緩衝液によるproBNPのシアル酸の化学変化であり、これは迅速にリン酸緩衝液で中和する事で解決出来る。2つ目はこの中和過程で生じる塩が糖化proBNPの精製の純度を低下させる。従来はミニ透析を数回行っていたが、塩が残存し、精製は不十分で、回収率も低下させた。C18カラムを用いて予備実験を行った所、アセトニトリル35%でC18カラムに結合したペプチド成分の回収を行うと、約85%の回収率が得られ、塩もほぼ除去出来る事が確認された。これらのことに注意して、糖化proBNPの精製を行っていく予定である。最終的に質量分析装置による糖鎖構造の解明に結びつけたい。臨床研究も、従来我々が築き上げて来たproBNP、matureBNPを用いて新しいマーカーの提唱に結びつける事が出来たのと、さらにproANPの新知見を報告できたので、今後これらの知見をさらに発展させて、心不全の病態生理の解明やバイオマーカーとしての意義を確立していきたい。

Causes of Carryover

英文論文校正費用が2件生じたが、予想より金額が安価だったのと、為替の関係もあり、8575円残りました。来年度も、糖鎖解析の研究の物品費、英文校正費用等に使用予定と致します。

  • Research Products

    (11 results)

All 2019 Other

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 4 results) Presentation (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Change in the NT-proBNP/Mature BNP Molar Ratio Precedes Worsening Renal Function in Patients With Acute Heart Failure: A Novel Predictor Candidate for Cardiorenal Syndrome2019

    • Author(s)
      Takahama H, Nishikimi T, Takashio S, Hayashi T, Nagai-Okatani C, Asada T, Fujiwara A, Nakagawa Y, Amano M, Hamatani Y, Okada A, Amaki M, Hasegawa T, Kanzaki H, Nishimura K, Yasuda S, Kangawa K, Anzai T, Minamino N, Izumi C
    • Journal Title

      J Am Heart Assoc

      Volume: 8 Pages: e011468

    • DOI

      10.1161/JAHA.118.011468

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] A Mixture of Glycosylated proBNP and BNP-32 Is a Suitable Calibrator for BNP Immunoassays2019

    • Author(s)
      Masuta K, Funatsuki K, Inoue Y, Masud I, Nishikimi T, Nakagawa Y, Horii K, Nishi H. Irgarashi M, Ota N
    • Journal Title

      Open Journal of Clinical Diagnostics

      Volume: 9 Pages: 51-63

    • DOI

      10.4236/ojcd.2019.92004

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Dose impaired processing of pro-B-type (or brain) natriuretic peptide cause decreased plasma BNP levels in obese heart failure patients?2019

    • Author(s)
      Nishikimi T, Nakagawa Y
    • Journal Title

      Ann Transl Med

      Volume: 7 Pages: S221

    • DOI

      10.21037/atm.2019.08.56

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Superiority of proatrial natriuretic peptide in the prognostic power in patients with acute decompensated heart failure on hospital admission: compareson With B-type natriureteic peptide and other natriuretic peptide forms2019

    • Author(s)
      Takashio S, Takahama H, Nishikimi T, Hyashi T, Nagai-Okatani C, Matuso A, Nakagawa Y, Amano M, Hamatani Y, Okada A, Amaki M, Hasegawa T, KanzakiH, Yaduda S, Kangawa K, Anzai T, Minamino N, Izumi C
    • Journal Title

      Open Heart

      Volume: 6 Pages: e001072

    • DOI

      10.1136/openhrt-2019-001072

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] 心不全診療におけるBNP解釈のピットフォール -BNPを課題浄化もしくは過小評価する病態-2019

    • Author(s)
      錦見俊雄、中川靖章
    • Journal Title

      Heart view

      Volume: 8 Pages: 28-36

  • [Presentation] Increased Gαo expression plays a pivotal role in the progression of heart failure by impairing Ca2+ handling2019

    • Author(s)
      Hideaki Inazumi, Koichiro Kuwahara, Yoshihiro Kuwabara, Yasuaki Nakagawa, Hideyuki Kinoshita、Kenji Moriuchi, Hiromu Yanagisawa, Toshio Nishikimi,Kazuwa Nakao, Takeshi Kimura
    • Organizer
      BCVS2019
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Increased Gao expression underlies cardiac dysfunction and lethal arrhythmias accompanied with abnormal Ca2+ handling2019

    • Author(s)
      Inazumi H, Kuwahara K, Kuwabara Y, Nakagawa Y, Kinoshita H, Moriuchi K, Yanagisawa H, Nishikimi T, Oya M, Yamada M, Kashihara T, Kurebayashi N, Sugihara M, Nakao K, Kimura T.
    • Organizer
      European Society of Cardiology2019
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 抑制性G蛋白サブユニットGαoの発現亢進はCa2+ handlingの異常を介して心不全進展にかかわる2019

    • Author(s)
      稲住英明 桑原宏一郎 桒原佳宏 中川靖章 木下秀之 森内健史 柳澤洋 錦見俊雄 大矢未来 山田充彦 柏原俊英 呉林なごみ 中尾一和 木村剛
    • Organizer
      第56回日本臨床分子医学会学術集会
  • [Presentation] TRPC3/TRPC6チャネルを標的とした新規肺高血圧症治療の検討2019

    • Author(s)
      森内健史 木下秀之 中川靖章 西田基宏 森泰生 中村一文 錦見俊雄 稲住英明 柳澤洋 大矢未来 中尾一和 桑原宏一郎 木村剛
    • Organizer
      第4回J-ISCP年次学術集会 国際心血管薬物療法学会日本部会(J-ISCP)
  • [Presentation] Increased expression of Gαo plays a pivotal role in the progression of heart failure by impairing Ca2+ homeostasis2019

    • Author(s)
      H Inazumi, K Kuwahara, Y Kuwabara, Y Nakagawa, H Kinoshita, K Moriuchi, H Yanagisawa , T Nishikimi , M Oya, M Yamada, T Kashihara, N Kurebayashi, M Sugihara, K Nakao, T Kimura
    • Organizer
      第36回国際心臓研究学会日本部会
  • [Remarks] 京都大学医学部付属病院循環器内科 心血管内分泌代謝グループ

    • URL

      http://kyoto-u-cardio.jp/kisokenkyu/endocrine/

URL: 

Published: 2021-01-27  

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