リアノジン受容体内ドメイン制御による新しい不整脈、心不全治療

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08108
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 山本 健 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (50363122)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小田 哲郎 山口大学, 医学部附属病院, 助教 (40569290) ; 小林 茂樹 山口大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (90397993)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: リアノジン受容体 / カルモジュリン / 不整脈 / 心肥大

Outline of Annual Research Achievements

１．作成したCaM高親和性RyR2変異マウスを我々が保有している３つのCPVT型KIマウスR2474S KIマウスの掛け合わせを行い、genotyping後、ヘテロマウスが抗不整脈性を獲得しているか否かを検討した。その結果このマウスはテレメトリーによる24時間ECGモニタリング、及びepinephrineの投与でWTマウスに比べ強い不整脈耐性を示した。これはJCI insightに報告した。
２．CaM HAマウス KIマウスに対してTAC作成4、8週間後に心エコーにて左室径・壁厚、fractional shorteningを計測した後、エピネフリン/運動負荷による不整脈誘発試験を行った。その結果、CaMHAマウスにおいては、心肥大が著明に抑制されていたが、収縮性は保たれていた。さらに、心筋細胞を単離培養し以下を計測した；①Ca2+ transient、SR Ca2+ content、Ca2+ spark、cell shortening；②anti-CaM,anti-GRK5, anti-HDAC4,5, anti-p-HDAC4,5の抗体を用いた免疫染色によるCaM, HDAC, GRK5の核・細胞質内分布、リン酸化HDACの割合および心肥大遺伝子（BNP,c-fos, c-jun）の発現；③蛍光ラベルしたrecombinant CaM(F-CaM)の細胞内導入によるRyR2に対するCaM結合能。実験ではCaM HAマウスはTACにおいて非常に強い生存率の改善を見た。またこのマウスにおいてはCaMの核内移行がほぼ完全に抑えられており、HDACの核外移動もほぼ完全に抑えていた。現在論文投稿済みrevise中である。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

2年目に計画した実験はおおむね遂行できた。

Strategy for Future Research Activity

CaM HAマウスにおけるTAC後のCaM, HDAC, 肥大遺伝子の解析：
我々はRyR2CaM結合ドメイン(RyR2CaMBD)のmutated peptideを多数スクリーニングした結果、RyR2に対するCaMの結合を強める変異を見いだし、その変異RyR2を組み込んだノックイン(KI)マウス(CaM HAマウス)を作成した。このマウスの特徴はCaMには変異を加えてないのでCaMの他の蛋白質への結合には影響が無いことである。CaM HAマウスでは、DPc10（CPVTにおけるRyR2内の変異部位：R2474Sを含んだペプチドで、native domainと分子間競合してドメインunzipを引き起こす）によりCaMが解離しない、すなわちドメイン連関障害→CaM解離が起きないことを確認している。このCaM HAマウスに対してTACを行い8週間後に心筋細胞を単離し、①形態、予後、肥大遺伝子の発現を解析し、②固定してanti-CaM, anti-GRK5, anti-HDAC4,5, anti-p-HDAC4,5の抗体にて免疫染色を行う、Shamマウスでは（ドメイン連関障害→CaM解離を誘導;JMCC 2015）による刺激後、経時的に固定し同様の免疫染色を行う。③蛍光ラベルしたrecombinant CaM(F-CaM)を導入し、RyR2に対するCaMの親和性を計測する。④Ca2+ spark, SR Ca2+ content, field stimulation時のspontaneous Ca2+ transientを計測する。これらの解析によりドメイン連関障害→CaM解離を抑制するという介入が心肥大を抑止することができるかを検討する。

Research Products

• [Journal Article] Stabilizing cardiac ryanodine receptor prevents the development of cardiac dysfunction and lethal arrhythmia in Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIδc transgenic mice. (2020)
  • Author(s): Sufu-Shimizu Y, Okuda S, Kato T, Nishimura S, Uchinoumi H, Oda T, Kobayashi S, Yamamoto T, Yano M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 524 Pages: 431-438
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.01.107
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Factors limiting habitual exercise in patients with chronic heart failure: a multicenter prospective cohort study. (2020)
  • Author(s): Tadaki S, Sakata Y, Miura Y, Nochioka K, Miura M, Miyata S, Asakura M, Shimada K, Yamamoto T, Fukumoto Y, Kadokami T, Yasuda S, Miura T, Ando SI, Yano M, Kitakaze M, Daida H, Shimokawa H.
  • Journal Title: Heart Vessels Volume: 35 Pages: 655-664
  • DOI: 10.1007/s00380-019-01529-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dantrolene prevents ventricular tachycardia by stabilizing the ryanodine receptor in pressure- overload induced failing hearts. (2020)
  • Author(s): Kajii T, Kobayashi S, Shiba S, Fujii S, Tamitani M, Kohno M, Nakamura Y, Nanno T, Kato T, Okuda S, Uchinoumi H, Oda T, Yamamoto T, Yano M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 521 Pages: 57-63
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.10.071
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] G790del mutation in DSC2 alone is insufficient to develop the pathogenesis of ARVC in a mouse model. (2019)
  • Author(s): Hamada Y, Yamamoto T, Nakamura Y, Sufu-Shimizu Y, Nanno T, Fukuda M, Ono M, Oda T, Okuda S, Ueyama T, Kobayashi S, Yano M.
  • Journal Title: Biochem Biophys Rep Volume: 21 Pages: 100711
  • DOI: doi: 10.1016/j.bbrep.2019.100711
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ryanodine receptor-bound calmodulin is essential to protect against catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. (2019)
  • Author(s): Nakamura Y, Yamamoto T, Kobayashi S, Tamitani M, Hamada Y, Fukui G, Xu X, Nishimura S, Kato T, Uchinoumi H, Oda T, Okuda S, Yano M.
  • Journal Title: JCI Insight Volume: 4 Pages: 126112
  • DOI: 10.1172/jci.insight.126112.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Stabilization of CaMKII-phosphorylated RyR2 By Dantrolene Prevents the Development of Age-related Cardiomyopathy in CaMKIIδc Transgenic Mice (2019)
  • Author(s): Yoko Sufu-Shimizu, Shinichi Okuda, Yoko Okamoto, Takayoshi Kato, Hitoshi Uchinoumi, Tetsuro Oda, Shigeki Kobayashi, Takeshi Yamamoto, Masafumi Yano
  • Organizer: AHA Scientific Sessions 2020
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Difference of Calmodulin-Ryanodine Receptor Affinity Between N-terminal, Central and C-terminal RyR2-CPVT Knock-in Mice (2019)
  • Author(s): Hitoshi Uchinoumi, Xiaoqiong Dong, Ivanita Stefanon, Mena Said, Rogerio Faustino, Razvan L Cornea, Univ of Minnesota, Xander H.t. Wehrens, Takeshi Yamamoto, Masafumi Yano, Donald M Bers
  • Organizer: AHA Scientific Sessions 2020
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Critical Role of Ryanodine Receptor Bound Calmodulin to Prevent Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia (2019)
  • Author(s): Yoshihide Nakamura, Takeshi Yamamoto, Shigeki Kobayashi, Masaki Tamitani, Yoriomi Hamada, Go Fukui, Xiaojuan Xu, Shigehiko Nishimura, Takayoshi Kato, Hitoshi Uchinoumi, Tetsuro Oda, Shinichi Okuda, Masafumi Yano
  • Organizer: AHA BCVS 2019
  • Int'l Joint Research