特発性肺線維症に対する革新的な分子標的治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08145
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 角川 智之 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 客員研究員 (90570953)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 特発性肺線維症 / HSP47

Outline of Annual Research Achievements

特発性肺線維症は根治治療が存在しない難病であり、新規治療薬開発が急務である。申請者らは、コラーゲン合成に必要不可欠な蛋白質であるHeat shock protein (HSP) 47が、各種線維化疾患においては線維化進展を促進し負の生理作用をもたらすことを実証した。本研究は、①HSP47に対するsiRNAを用いた直接的なHSP47発現抑制、②HSP47 inhibitorを用いたHSP47シャペロン機能の抑制、という２つの異なるアプローチを用い、“HSP47をターゲットとした分子標的治療”という新しい観点から線維化を抑制する治療法を創出することを目的とし研究を行った。特に組織移行に関しては、肺指向性・長時間作用持続型の新規ナノDDS製剤を組み合わせることにより、高効率にHSP47発現を制御する方法を検討した。
正常ヒト成人肺線維芽細胞を用いて、TGF-β1およびHSP47 inhibitorによる、HSP47遺伝子発現およびHSP47タンパク質産生量に対する効果を解析した。その結果、TGF-β1はHSP47遺伝子の発現を顕著に促進すること、そして、HSP47 inhibitorはHSP47遺伝子発現を顕著に抑制することが示された。さらに、タンパク質レベルでも、TGF-β1はHSP47タンパク質の産生を促進し、HSP47 inhibitorは顕著に抑制することが示された。さらに、ブレオマイシン肺線維症モデルでのin vivoにおける抗線維化効果を検討した。HSP47 inhibitorは、マウスの生存率を改善させ、体重減少も抑制することが見いだされた。
また、マウス肺線維芽細胞に対して、肺指向性遺伝子ベクターによってHSP47 siRNA transfection を行い、HSP47 mRNA をRT-PCRを用いて測定し、そのknock down 効率を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では、まずin vitroにおけるHSP47 inhibitorの効果を検証した。正常ヒト成人肺線維芽細胞（normal human lung fibroblasts：NHLF）を用いて、TGF-β1およびHSP47 inhibitorによる、HSP47遺伝子発現およびHSP47タンパク質産生量に対する効果を解析した。その結果、TGF-β1はHSP47遺伝子の発現を顕著に促進すること、そして、HSP47 inhibitorはHSP47遺伝子発現を顕著に抑制することが示された。さらに、タンパク質レベルでも、TGF-β1はHSP47タンパク質の産生を促進し、HSP47 inhibitorは顕著に抑制することが示された。さらに、ブレオマイシン肺線維症モデルにHSP47 inhibitorを投与しin vivoでの抗線維化効果を確認する実験に進んでいる。現段階でHSP47 inhibitorを投与することにより、ブレオマイシン肺線維症モデルマウスの生存率を改善させ、体重減少も抑制することが見いだされている。現在、肺組織内の病理学的な評価やHSP47やコラーゲン、線維化に関与する各種メディエータのmRNAや蛋白レベルでの発現状況について詳細な検討を追加している。
これらの進捗状況は、概ね当初の予定通りである。

Strategy for Future Research Activity

上記のようなin vitroでの結果をもとに、現在in vivoでの治療実験を開始し、進めている。ブレオマイシン肺線維症モデルマウスを用い、経時的に肺組織中のHSP47発現動態を詳細に解析し、同時に採取した血清中HSP47濃度測定を行うことにより、肺組織中のHSP47発現と血清中HSP47濃度との関連について検討を行う。最終的には血清中HSP47濃度測定を行うことにより肺組織中のHSP47発現動態を把握する方法を確立する。さらに、動物モデルを用い、HSP47 inhibitorを投与することによる線維化病変局所におけるHSP47発現制御法を確立し、線維化進行抑制効果を検討する。ブレオマイシン肺線維症モデルや急性肺損傷モデルに関しては、本研究代表者が既に確立した方法を用いる。さらに、今後はHSP47 siRNAを肺組織に送達させ、in vivoでのHSP47発現制御を行うことを計画している。
また、これまでに、マウス肺線維芽細胞に対して、肺指向性遺伝子ベクターによってHSP47 siRNA Transfection を行い、HSP47 mRNA をRT-PCRを用いて測定し、そのknock down 効率をLipofectaminによるTransfectionと遜色ない事を確認している。今後は同様に肺指向性遺伝子ベクターによるHSP47 siRNA Transfection がHSP47蛋白質、1型コラーゲン蛋白質の発現に与える影響をWB により確認し、同時にそのViabilityをMTT assayを用いて確認する方針である。

Causes of Carryover

In vitroの実験は当初予定よりも順調に進んでいるが、in vivoの実験は当初予定よりも若干遅れているため、次年度使用額が発生した。今後in vivoの実験を進めるにあたり、動物の購入、飼育、薬剤の投与などを進めるために使用する計画である。