Development of a selective culture method for pulmonary epithelial stem cells using high-performance immunotoxin

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08151
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 山口 美樹 札幌医科大学, 医学部, 助教 (10530454)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐久間 裕司 札幌医科大学, 医学部, 准教授 (10364514) ; 内田 宏昭 東京大学, 医科学研究所, 特任准教授 (20401250) ; 角 俊行 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (60772291) [Withdrawn] ; 田中 悠祐 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (70792125) [Withdrawn] ; 多田 周 札幌医科大学, 医学部, 研究員 (00815441)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 肺上皮幹細胞 / 選択的培養法 / イミュノトキシン / 抗体

Outline of Annual Research Achievements

初年度については肺上皮幹細胞の選択的培養に用いる抗体の選別を中心に行った。ディスパーゼならびにコラゲナーゼを用いて正常肺組織から肺細胞を取り出しヒト肺細胞（HuL細胞）とした。このHuL細胞には肺胞上皮（Ⅰ型およびⅡ型）、血管内皮細胞、間質系細胞およびマクロファージなどの血液系細胞が多数含まれているため、肺胞上皮幹細胞を選択するにはこれらの細胞を除く必要があった。第一段階としてこれらの細胞の除去を目的に培養を試みた。BEGM培地(Lonza社)で培養することで間葉系および血液系の殆どの細胞は死滅し、この環境で樹立される細胞の大半は肺上皮系の未熟な細胞集団と考えられた（TROP2+ITGA6+CD24low細胞）。この細胞を更にマトリゲル上に播種し3D培養をすることで肺胞上皮および気管支上皮の性質を持った細胞へ分化することが可能であった。また、ブレオマイシンで肺を損傷させた免疫不全マウス（NSGマウス）の気道から肺に移植することで、これらの細胞はマウス肺に生着し更に気管支ならびに肺胞様構造が確認出来た（Tanaka Y, Yamaguchi M,et al. Exp Cell Res. 2018 Nor 15;372(2):141-149.）。以上の結果からBEGM培地で培養された細胞は肺上皮幹細胞に極めて近い細胞集団であり、HuL細胞をBEGM培地で培養するだけで第一段階の選択的培養は確立できた。
しかしながら、この環境で長期培養すると間葉系細胞が出現し目的細胞（肺上皮幹細胞様細胞）の増殖は抑制され、殆どの細胞が間葉系細胞（CD90+CD73+細胞）に変化することが分かった。ここで出現した間葉系細胞を除去することで肺上皮幹細胞の長期培養が可能になると考えられた。現在、内在化能がある間葉系細胞に発現する抗体の樹立を進めている。現時点で候補抗体が40個樹立できており、抗原同定を行っているところである。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

我々の目的は肺上皮幹細胞の効率的な培養系の確立である。現時点でBEGM培地で培養するだけで肺上皮幹細胞様細胞が選択的培養が確立できた。これは第一段階が成功していることが示される。また、次の段階である抗体を用いた肺幹細胞の長期選択培養についてもいくつかの抗体が樹立できており、順調に進捗している。

Strategy for Future Research Activity

今後は、現在樹立済みの抗体の抗原同定と得られた抗体の特異性を調べ、抗体による選択的培養を完成させる。

Causes of Carryover

（理由）
納入に時間を有する試薬（輸入）が含まれていたため、当該年度の納入が出来なかった。
（使用計画）
輸入試薬は新年度早々に納入されるため、直ちに使用できる。

Research Products

• [Journal Article] Characterization of distal airway stem-like cells expressing N-terminally truncated p63 and thyroid transcription factor-1 in the human lung. (2018)
  • Author(s): Tanaka Y, Yamaguchi M, Hirai S, Sumi T, Tada M, Saito A, Chiba H, Kojima T, Watanabe A, Takahashi H, Sakuma Y.
  • Journal Title: Exp Cell Res. Volume: 372(2) Pages: 141-149
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2018.09.020