2018 Fiscal Year Research-status Report
The identification and assessment of novel disease related gene for pulmonary hypertension
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18K08183
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| Research Institution | International University of Health and Welfare |
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Principal Investigator |
田村 雄一 国際医療福祉大学, 医学部, 准教授 (00468498)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 肺高血圧症 / 疾患関連遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は原因不明の難病疾患である肺高血圧症、特に肺動脈性肺高血圧（PAH）の発症にかかわる新規原因遺伝子を特定し根治療法に結び付けることを目的としたものである。PAHに関しては複数の遺伝子異常が同定されているが、申請者はすでに新規疾患関連遺伝子PDE1AをGWASシステムを用いて同定しており、本研究では申請者が代表研究者を務め、PAH患者レジストリを展開している厚生労働省科学研究費研究班（田村班Ⅱ）に参加する肺高血圧症診療施設が連携し、PDE1Aに関連した遺伝子変異と臨床的影響を網羅的に解析し、レジストリとゲノムデータと結びつけて難病におけるPhenotypeとGenotypeを比較検討することで肺高血圧症の病態解明および効果的な治療法に結び付ける。
本年度はシーケンサーを用いたPDE1A遺伝子および上流領域の解析を行った。GWAS解析で発見された疾患関連候補遺伝子PDE1Aの遺伝子領域およびそのプロモーター領域に対して遺伝子変異検索をおこなう。肺動脈性肺高血圧症患者において本遺伝子の発現はupregulationしていることが示唆されているため、特にプロモーター変異の領域に関する評価を重点的に行った。具体的な方法として、Exon領域に対してはサンガー法を用いて検索を行う。20検体の特発性肺動脈性肺高血圧症患者に対してExon領域の検索を行ったが、コモンSNPを除いて機能変異を示唆するSNPは同定されなかった。
次にプロモーター領域の解析に関しては、網羅的に解析を行うため、ロングリードをカスタマイズして行うことができる新世代シーケンサーであるNanoporeテクノロジーを用いた解析手法を確立した。ロングリードのターゲットシーケンスが可能なプライマー配列を特定し、DNAの転写開始点の上流の3kbpの配列の検索を行うことができるNanoporeテクノロジー上での条件設定を行った。その結果、100リードを超える十分なリードデプスが確保できるシーケンシング条件を確立することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々の先行報告ではPDE1A遺伝子は肺動脈性肺高血圧症患者において機能亢進していることが示唆されていたため、Exon領域に機能変異をきたす変異個所が同定される可能性は低いと考えられていた。当初の計画通り変異がないことを確認できた。
次にプロモーター領域を含む上流の遺伝子解析に関しては、サンガー法を用いずに安価にロングリード解析が可能となるNanoporeテクノロジーを用いた解析手法を確立することができた。それにより、数千bpの長い領域を繰り返しサンガー法で解析することなく、一気に解析できる系を確立できており、来年度以降の検証が予定よりも順調に進行することも期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロモーター領域における変異の検索：Nanoporeテクノロジーを用いて検索した上流領域の配列比較を他の哺乳類と行う。相同性をプロットし、相同性のあるところにコンピューター上でmotif検索を行うことで、DNAの直上流以外にも発現変化に寄与する可能性がある候補配列の同定を行う。続いて候補の領域に対してサンガー法によるシーケンスを行うことで、頻度の多い変異を同定することができる。
次に特定したプロモーター領域のレポーターアッセイを予定する。同定したプロモーター領域の変異に関して、ルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイを行う。変異プロモーターを再現したルシフェラーゼ遺伝子のDNAを作成し、コントロールを比較して発現量の上昇が認められるかどうかを確認することで、同定されたプロモーター領域が発現亢進に寄与しているかどうかの検討を行う。
さらに患者レジストリを用いたphenotype-genotypeの検証を行う。PDE1Aの変異はPAHにおける新規疾患関連遺伝子であることが期待されると同時に、ホスホジエステラーゼ自体が肺高血圧症の病気の進展に深くかかわっていることから、本遺伝子変異と治療反応性や予後が関与している可能性が期待される。そこで、遺伝子解析を行った症例を対象として、患者レジストリを用いた治療反応性の評価や予後との関連を調べることで、PDE1Aの変異と活動性との関連を検索する。
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| Causes of Carryover |
当初の見積もりと研究物品購入の際の実際の請求額の間に多少の誤差が生じたものであり、研究計画および進捗状況に影響を与えるものではない。
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[Journal Article] Risk stratification and medical therapy of pulmonary arterial hypertension2019
Author(s)
Galie N, Channick RN, Frantz RP, Grunig E, Jing ZC, Moiseeva O, Preston IR, Pulido T, Safdar Z, Tamura Y, McLaughlin VV
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Journal Title
Eur Respir J
Volume: 53(1)
Pages: pii: 1801889
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Balloon pulmonary angioplasty for chronic thromboembolic pulmonary hypertension: A systematic review2018
Author(s)
Tanabe Nobuhiro, Kawakami Takashi, Satoh Toru, Matsubara Hiromi, Nakanishi Norifumi, Ogino Hitoshi, Tamura Yuichi, Tsujino Ichizo, Ogawa Aiko, Sakao Seiichiro, Nishizaki Mari, Ishida Keiichi, Ichimura Yasunori, Yoshida Masahiro, Tatsumi Koichiro
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Journal Title
Respiratory Investigation
Volume: 56(4)
Pages: 332～341
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Ectopic upregulation of membrane-bound IL6R drives vascular remodeling in pulmonary arterial hypertension2018
Author(s)
Tamura Yuichi, Phan Carole, Tu Ly, Le Hiress Morane, Thuillet Raphael, Jutant Etienne-Marie, Fadel Elie, Savale Laurent, Huertas Alice, Humbert Marc, Guignabert Christophe
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Journal Title
Journal of Clinical Investigation
Volume: 128(5)
Pages: 1956～1970
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Uric acid contributes to the progression of pulmonary hypertension in rodents and humans2018
Author(s)
Laurent Savale, Satoshi Akagi, Ly Tu, Raphael Thuillet, Jennifer Bordenave, Thimote Quatremare, Amelie Cumont, Carole Phan, Alice Hueretas, Marc Humbert, Yuichi Tamura, Christope Guignabert.
Organizer
ERS International Congress 2018
Int'l Joint Research
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