2019 Fiscal Year Research-status Report
嚢胞腎発症を制御する一次繊毛からのシグナル経路の解析
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18K08215
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
中島 由郎 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30455430)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ネフロン癆 / 一次繊毛 / ANKS6 / ANKS3 / BICC1 / RNA結合タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者は、ネフロン癆の発生機序の解明を目的として「一次繊毛からの細胞内シグナル伝達経路」の分子基盤を確立することを目指している。ネフロン癆の責任遺伝子産物（NPHP）は主に一次繊毛に局在することが知られているが、NPHPのひとつANKS6（NPHP16）は一次繊毛のみならず、細胞質内での局在も確認されている。近年の報告により、ANKS6は同じくネフロン癆の責任遺伝子産物と考えられるANKS3及びBICC1と複合体を形成することがわかってきた。よってネフロン癆発症メカニズムを解明するためにはANKS6だけでなくANKS3とBICC1を含めた複合体としての機能を探ることが必要である。
BICC1はRNA結合タンパク質で標的RNAの翻訳調節に関わっていることが示唆されている。そこでANKS6とANKS3についてもRNAの翻訳調節に関与しているかどうかを調べた。その結果、ANKS6とANKS3ともにBICC1と同様にRNA結合タンパク質に結合していることがマウス腎臓組織を材料とした免疫沈降実験でわかった。具体的にはANKS6とANKS3はRNAの翻訳抑制や分解に関わるタンパク質、DCP1a、XRN1、CNOT1、DDX6などと生理的な条件で結合していた。一方、翻訳開始因子であるeIF4F複合体とBICC1/ANKS3/ANKS6複合体との結合は確認されなかった。よってBICC1/ANKS3/ANKS6複合体がRNAの翻訳抑制に関与している可能性を見出した。
一方、ANKS6が一次繊毛と細胞質内に局在が確認されたことから、この2つの異なる構造体間をANKS6が移動している可能性が示唆されている。これを証明するためにAPEXという酵素によって繊毛タンパク質をラベリングする方法を試みている。この方法に問題が生じたために、部分的な改良と、代替法の両方を試行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現状、ANKS6の細胞内動態を調べるための繊毛タンパク質ラベリング法の立ち上げには当初の想定以上に時間を要している。APEXを一次繊毛に局在させることで、繊毛に局在するタンパク質をビオチン化する予定であった。このためにはAPEXが一次繊毛のみに局在することが必要であった。しかし、ベクタープラスミドを作製し、遺伝子導入してAPEXを発現させたが、一次繊毛だけでなく細胞質全体にもAPEXの局在がみられた。このため一次繊毛タンパク質特異的にラベリングすることが困難と考えられた。現在、使用した繊毛局在シグナルを変更するベクタープラスミドの作製を行っており、これを再度、細胞に導入して局在を確認する予定である。
また、代替案としてANKS6と蛍光タンパク質を融合して、この融合タンパク質の動態をライブ観察することを計画していたが、これについてもANKS6の過剰発現が細胞死を引き起こしてしまった。これを解決するためにノックインによりANKS6と蛍光タンパク質の融合させ、ANKS6の動態をライブ観察する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初は、ANKS6の機能解析のみを予定していたが、ANKS6が同じくネフロン癆の責任遺伝子産物と考えられるANKS3及びBICC1と複合体を形成することがわかってきた。よってネフロン癆発症メカニズムを解明するためにはANKS6だけでなくANKS3とBICC1を含めた複合体としての機能を探ることが必要になった。今後は、BICC1/ANKS3/ANKS6複合体での細胞内局在解析や機能解析を行っていく。
ANKS6の細胞内動態解析は、繊毛ラベリング法については別の繊毛局在シグナルの使用、融合タンパク質の作成はノックインを利用してそれぞれ行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由:一部の消耗品において当初の見込額よりも安価に購入できたものがあり、その結果として差額が生じることとなった。
使用計画:消耗品の購入を予定している。
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