2019 Fiscal Year Research-status Report
単糖代謝阻害剤を標的とした嚢胞性腎疾患群の病態機序解明と薬効の検証
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18K08257
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
中嶋 和紀 藤田医科大学, 共同利用研究設備サポートセンター, 講師 (10442998)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | グルコシルセラミド / O-GlcNAc化 / 嚢胞性腎疾患 / グルコース代謝 / マンノース代謝 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では「糖鎖修飾」に着目して、常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）の病態機序を明らかにする。近年のゲノム研究から糖鎖合成酵素や単糖代謝酵素の変異がADPKD患者で報告され、糖鎖の病態への関与が注目されているが、その機序は不明なところが多い。本研究は、単糖代謝により生み出される様々な糖鎖分子が連動して細胞増殖を調節するという仮説に基づきADPKDの病態悪性化機構を解明する。特に①糖脂質代謝と②細胞質O-グルコシル化に焦点をあて、その細胞内シグナル伝達を阻害する③単糖代謝阻害剤を探索、その効果や機序を明らかにする。本年度は単糖代謝阻害剤を入手し、糖鎖変化と病態抑制効果を検討した。
単糖代謝阻害剤は既報の6-アルキニルフコースと、2-デオキシグルコースや2-デオキシマンノース、さらに有機合成したそれらのアジドやアルキン誘導体を使用した。具体的には マンノースやグルクロン酸などの5種類の化合物を嚢胞腎細胞株に添加し、レクチンブロットにより糖鎖変化、MTTアッセイにより細胞増殖を評価した。その結果、6-アルキニルフコースは健常人由来尿細管細胞で糖鎖合成を阻害したが、嚢胞腎細胞に対しては影響がなかった。またマンノース誘導体は嚢胞腎細胞株の増殖を殆ど抑えなかった。キシロース誘導体は嚢胞腎に対して強い増殖抑制効果を示したが、健常人細胞株に対して効果が弱かった。この結果は本化合物が嚢胞腎を効果的に抑える阻害剤であることを示唆している。
次に薬効機序を明らかにするため細胞質O-グルコシル化に着目した。その一環としてプロテオミクス技術を構築することから開始した。O型糖鎖修飾したタンパク質解析で得られるデータを解析するソフトウェアを共同研究論文で報告した。
以上、本年度は単糖代謝阻害剤の候補化合物を選定して、その効果を検証するための解析基盤を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究は単糖代謝を介するADPKDの病態機序解明を目指して、１）糖脂質代謝を介した病態悪性化機構、２）O-GlcNAc化の関与、３）単糖代謝阻害剤の薬効検証、４）トルバプタンとの薬剤併用法を検討する。令和元年度は３）を主に行った。
２）ではO-GlcNAc化タンパク質をプロテオミクス解析する技術が整った。O-GlcNAc化タンパク質はO-GlcNAc Enzymatic labeling technologyを用いて標識し、ビオチンーアビジン系で濃縮、さらに磁器ビーズ上でトリプシン消化、解析できるようになった。
３）の研究では２つの興味深い結果が得られつつある。１つ目は、2-デオキシグルコースの新たな生理作用である。2-デオキシグルコースが嚢胞腎細胞の増殖を抑えることは明らかであったが、神経上皮細胞株に対しては細胞の形態を変化させ嚢胞化を促進した。2-デオキシグルコースはADPKDの病態抑制目的で臨床研究が進められているが薬効多様性を改めて評価する必要があると考えられた。そこで次年度は、プロテオミクスやメタボロミクスにより、2DG処理前後で発現変動する分子を同定する。
＜２＞マンノースをアセチル化したペンタアセチルマンノースは、マンノースに比べて細胞増殖を強く抑えていた。他にもマンノースの多糖ポリマーであるマンナンの効果を検討する。細胞数への影響やアポトーシス、シグナル調節キナーゼ（ERK）のリン酸化を解析しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は２）のO-GlcNAc化タンパク質の解析を本格的に行い、薬効との関わりを明らかにする。現状見出している単糖代謝阻害剤やマンノース関連化合物を嚢胞腎モデル細胞やモデル動物に添加し、標的になるO-GlcNAc化タンパク質を同定する。またO-GlcNAc転移酵素阻害剤の影響を検証することにより修飾の役割を明らかにする。
またマンノースに着目した研究も並行する。本実験はマンノースが抗腫瘍効果をもたらすという最新の知見に基づく (Gonzalez et al. Nature,2018)。一方、昨年度の我々の成果として、マンノース活性体の一つであるUDP-マンノースが存在することを明らかにした。本研究では、それら病態悪性化との関わりを解析する。
単糖代謝阻害剤の薬効は、以上の実験で得た知見をもとにして動物実験により検証する。トルバプタンとマンノースを病態進行が緩やかな常染色体劣性多発性嚢胞腎のモデルマウスに投与して、併用効果を検証する。その評価は、モデル動物の腎機能や腎病理、腎容積および血清クレアチニン値を解析する。
以上のように単糖代謝阻害剤やマンノース関連化合物の中から、臨床に早く還元できそうな候補化合物を選択する。将来的に低用量2-DG療法などを例にして、トルバプタンと併用するADPKDの補助療法を提唱したい。
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| Causes of Carryover |
申請者は昨年4月に研究機器の管理を本務とするセンターに学内異動した。またタンパク質解析が本務になったため、プロテオミクス研究を優先的に進めている。動物実験等を行う時間が減ったため研究が遅れ始めている。したがって、その研究を行うための経費は次年度に使用する。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Analysis of O-glycoforms of the IgA1 hinge region by sequential deglycosylation.2020
Author(s)
Ohyama Y, Yamaguchi H, Nakajima K, Mizuno T, Fukamachi Y, Yokoi Y, Tsuboi N, Inaguma D, Hasegawa M, Renfrow MB, Novak J, Yuzawa Y, Takahashi K.
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Journal Title
Sci Rep.
Volume: 10(1)
Pages: 671
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Free Glycans Derived From O-mannosylated Glycoproteins Suggest the Presence of an O-glycoprotein Degradation Pathway in Yeast2019
Author(s)
Hirayama H, Matsuda T, Tsuchiya Y, Oka R, Seino J , Huang C, Nakajima K , Noda Y, Shichino Y, Iwasaki S , Suzuki T
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Journal Title
J Biol Chem
Volume: 294(44)
Pages: 15900
DOI
Peer Reviewed
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