非平衡大気圧プラズマ（冷たいプラズマ）を用いたメラノーマに対する新規治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08270
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 白石 研 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (80710863)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神野 雅文 愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 教授 (30274335) ; 本村 英樹 愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 准教授 (80332831)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: メラノーマ

Outline of Annual Research Achievements

まず、メラノーマ細胞を用いて、本実験に適した平衡大気圧プラズマ発生装置の照射条件（照射間隔、電圧、波長など）を決定した。また、ディッシュに均等にプラズマが照射できるようにプラズマ発生装置の改良を行った。次に、プラズマ発生装置を用いて、培養メラノーマ細胞にプラズマを直接照射した場合、あるいはプラズマ培養液でメラノーマ細胞を培養した場合の細胞増殖抑制効果を調べた。プラズマ照射液はプラズマ発生装置から1.5cm離した部位から通常培養液に照射し、0、0.5、1、3、5、10、15、30分の異なる照射時間後に回収した。あらかじめ通常培養したメラノーマ細胞の培養液を、回収したプラズマ培養液と交換して24-72時間後の生存細胞数をCCKアッセイにより評価した。その結果、プラズマの直接照射およびプラズマ照射液ともに、照射時間依存性にメラノーマの生存率（増殖）を抑制することができた。また、今回使用したプラズマ照射液中の温度やPHなどは大きく変化していないことを確認し、凍結保存で再使用が可能であることも確認した。（冷蔵保存では数週間で効果が減弱することも確認している）現在は、プラズマ照射による遊走能の抑制効果について、トランスウェルを用いた遊走アッセイやbiogelやストッパーを用いたgap closure遊走アッセイで解析中である。更に、浸潤能の抑制効果についても、コラーゲン、ラミニン、基底膜マトリクス（ECM）などでコートされたメンブレンを通過した細胞を蛍光で標識し検出することにより評価している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでの研究でプラズマ発生装置の改良を行い、本実験の遂行に最も適した条件を決めることができた。また、プラズマ照射によりメラノーマの増殖が抑制されることを確認した。現在までは、おおむね順調に計画通りに研究が進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

今後は、プラズマ照射によるメラノーマ細胞のアポトーシス誘導をTrypan blue染色、Annexin-V/PI染色、カスパーゼ３、cleavage assay、TUNEL染色などで確認する。また、プラズマ照射細胞と非照射細胞におけるアポトーシス関連の遺伝子発現スクリーニングを行い、いかなる因子の発現がプラズマ照射により誘導されるのかを明らかにする。更には、プラズマのマウスにおける抗腫瘍効果の検討や遺伝子スクリーニングで特定した遺伝子の関与をマウスで明らかにする予定である。

Causes of Carryover

本実験に使用するメラノーマ培地、ピペット類一式、培養ディッシュなどの物品を購入予定として計上していたが、当教室に使用可能な既存の物品があったため、50228円の未使用額が生じた。本額と翌年度分として請求した助成金は、「プラズマによるメラノーマ細胞のアポトーシス誘導」および「抗腫瘍効果に関与する遺伝子スクリーニング」の実験に使用する予定である。