Development of new therapy for malignant melanoma using non-thermal atmospheric pressure plasma (cold plasma)

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K08270
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 白石 研 愛媛大学, 医学部附属病院, 講師 (80710863)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 神野 雅文 愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 教授 (30274335) ; 本村 英樹 愛媛大学, 理工学研究科(工学系), 准教授 (80332831)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: メラノーマ / 非平衡大気圧プラズマ / 増殖抑制

Outline of Annual Research Achievements

メラノーマ細胞にプラズマを直接照射すると照射部位の細胞は24時間後には大半が死滅したが、非照射部位の細胞も大半が死滅することを確認した。このことから、直接照射以外にも間接的な作用で細胞に影響を与えている可能性が考えられ、プラズマ照射培養液に注目した。プラズマを異なる時間で照射し回収した培養液を用いて、24-72時間後のメラノーマ細胞の増殖能をCCKアッセイで評価した結果、照射時間依存性にメラノーマの増殖を抑制できた。次に、トランスウェルを用いたマイグレーションアッセイおよびscratchやストッパーを用いたgap closureアッセイで、プラズマ照射培養液に暴露された細胞では遊走能が低下した。そこで、プラズマ照射培養液の解析を行い、プラズマ照射で温度やPHは大きく変化しないこと、添加した血清には影響を与えないこと、凍結保存でも再使用が可能であること、細胞との接触時間を減らしても抑制効果が見られることを確認した。プラズマ照射培養液に活性酸素除去剤を加えるとメラノーマ抑制効果が減弱することが分かり、活性酸素が増殖抑制に影響を与えていることが示唆された。また、プラズマ照射によるアポトーシス誘導をTrypan blue染色、Annexin-V/PI染色、TUNEL染色等で確認した。更にプラズマがメラノーマの増殖抑制を引き起こす分子学的メカニズムの解明を進め、プラズマ照射培養液および非照射培養液で培養した細胞におけるアポトーシス関連の遺伝子発現の変化をRT-PCRにより検索した結果、ある興味深い遺伝子の発現が大きく変化していた。現在、この遺伝子と抗腫瘍効果の関与を裏づけるマウス実験を進めている。また、プラズマ照射培養液で暴露後の細胞を経時的に電子顕微鏡で観察し、細胞の形態学的変化を確認している。更に、HPLCによりプラズマ照射した培養液中の組成変化や増殖抑制因子の同定を試みている。