Functional analyses of 230-kDa bullous pemphigoid antigen 1 as cell adhesion molecules and immunogenic epitopes

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08286
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 会津 隆幸 弘前大学, 医学研究科, 助教 (00400135)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松崎 康司 弘前大学, 医学部附属病院, 講師 (50322946)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: BP230-KOマウス / 細胞接着タンパク

Outline of Annual Research Achievements

BP230欠損による表皮の構造変化の解析、随伴する炎症発現のメカニズムを解明すること、後天性自己免疫性疾患であるBP発症に抗BP230抗体がどのように関与するのか明らかにすることを目的として以下の研究を行った。
1．BP230タンパク欠損による表皮水疱症発症の疾患モデルマウスの確立
① 表皮基底細胞でのみCreを発現するK5-CreマウスとBP230 conditional マウスと交配を繰り返し、表皮基底細胞でのみBP230をKOするマウス（BP230-KO）を作成、系統維持した。② BP230-KOマウス背部皮膚を採取、蛍光直接法で基底膜部のBP230タンパク欠損を確認した。また、皮膚から表皮のみを回収、ウエスタンブロット法でもBP230タンパク欠損を証明した。③ BP230-KOマウスを経時的に観察、びらん、紅斑発症時期を統計学的に集計した。④ 紅斑、びらん面を皮膚生検、光学顕微鏡下で表皮水疱症と同様の所見の有無を確認した。
2. BP230タンパク欠損のよるヘミデスモゾーム、デスモゾームの構造上の変化
① BP230-KOマウス背部皮膚を採取、電子顕微鏡でヘミデスモゾーム、デスモゾームの構造変化を確認した。② 直接蛍光抗体法にて、細胞接着タンパクの発現ならびにその局在の変化を解明した。③ 採取した皮膚よりRNAを回収、BP230タンパク欠損に伴う代償的なタンパク発現の変化をreal- time PCRで量的に確認した。④ 外用剤塗擦による炎症予防効果を、経時的に確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね研究実施計画に沿って研究行い、計画通り進展している。

Strategy for Future Research Activity

1. 表皮細胞遊走能の変化ならびに創傷治癒への影響
① BP230-KOマウス由来表皮細胞を培養し、その遊走能をタイムラプスで撮影、正常表皮
細胞と比較、検討する。② 直接蛍光抗体法で、BP180などHD構成タンパクの発現ならびにその局在を確認。③ BP230-KOマウス背部皮膚に人工的に6mmの皮膚欠損を作成、上皮化までの過程を経時的に観察。④ 適宜皮膚生検を行い、潰瘍底の伸長する表皮細胞のHD構成タンパクの発現を免疫組織化学染色で確認する。
2. BP230タンパクを標的としたBP発症モデルマウスの作成
① BP230のエクソン23、24をクローニング、約30個のアミノ酸からなるタンパクを発現す
るベクターを作成、大腸菌に形質転換させ、そのタンパクを回収。② BP230-KOマウス皮内に2週に1回投与、8週後に抗血清を回収。③ ELISA 法でそのタンパクに対する抗体産生を確認。④ C57BL/6マウス背部皮膚に抗血清を投与、後日皮膚生検を施行、直接蛍光抗体法で表皮基底膜に抗体、補体の沈着を確認する。⑤ 抗BP180 抗体、抗血清を皮内もしくは尾静脈から投与、BPで見られる紅斑、水疱形成など経時的に観察、適宜生検し表皮下水疱、炎症細胞浸潤など評価する。