2018 Fiscal Year Research-status Report
メラノーマの進展、および治療抵抗性におけるPIP3閾値モデルの検証
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18K08288
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
長田 真一 秋田大学, 医学系研究科, 准教授 (00244484)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | メラノーマ / イノシトールリン脂質 / PTEN / PI3K経路 / 免疫チェックポイント阻害薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究1年目となるH30年度は、以下の研究を行った。①メラノーマ・モデルマウス(BRAFV600E;Pten－/－)とInpp4b欠損マウスを交配し、Inpp4bをヘテロ欠損(BRAFV600E;Pten－/－;Inpp4b+/－)、あるいはホモ欠損(BRAFV600E;Pten－/－;Inpp4b－/－)で持つマウスを作製する。②①で作製したメラノーマ・マウスのメラノーマの数、大きさ、腫瘍ができるまでの期間、生存率、転移の有無などを調べ、PIP3レベルとの関連を比較する。③切除したメラノーマの手術標本を用いて、PTENとINPP4Bの免疫組織化学染色を行い、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類する。
①、②に関しては、順調に交配がすすみ、Pten、およびInpp4bの対立遺伝子数が異なるマウス、すなわち両者により産生されるPIP3レベルが異なるメラノーマ・マウスを作製することができた。また、PIP3レベルが上昇するにつれ、メラメラノーマの数、大きさが増え、腫瘍ができるまでの期間が短くなり、生存率も低下することがわかった。
③に関しては、切除したメラノーマの手術標本を用いる代わりにまず、市販のメラノーマの組織アレイを用いて、PTEN、およびINPP4Bに対する抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。その結果、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類されることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、PIP3レベルが異なるメラノーマ・マウスを作製することが、研究の進行度を決定することになる。そのためには、BRAFの活性化型変異（BRAFV600E）、Pten変異、Inpp4b変異に加え、色素細胞だけに変異を起こすためにタモキシフェン誘導性のTyr::CreERT遺伝子をもつマウスをスクリーニングする必要があった。これは、非常に時間と手間のかかる作業であったが、順調に交配が進み、発癌実験を行えるだけのマウスを手に入れることができた。また、組織アレイを用いてメラノーマにおけるPTEN、およびINPP4B発現レベルの傾向をつかむことができた。以上より、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2年目となるH31年度は以下の研究を行い、腫瘍のPIP3レベルが、腫瘍内の細胞障害性リンパ浸潤、免疫チェックポイント阻害薬感受性などにどのような影響を与えるかを調べる。そのために以下の研究を行う予定である。①腫瘍内PIP3レベルとメラノーマ・マウスのAKT-ｍTOR経路の活性化状態（ウェスタン・ブロット）、腫瘍浸潤性Tリンパ球の数 （免疫組織染色）、腫瘍内のTリンパ球の浸潤に関わるサイトカインの発現（定量的PCR法）がどのように関連するかを解析する。②H30年度に作製したPIP3レベルの異なるメラノーマから細胞株を樹立する。 ③②で樹立したメラノーマ細胞株を用いて、増殖能、浸潤能、転移能とPIP3量との相関を解析する。④②で樹立したメラノーマ細胞株を用いて、BRAFキナーゼ阻害薬、免疫チェックポイント阻害薬で処理し、PIP3レベルと治療抵抗性との相関関係を調べる。⑤当科で切除したメラノーマの手術標本を用いてPTENとINPP4Bの免疫組織化学染色を行い、PTENのみ発現が低下しているもの、INPP4Bのみ発現が低下しているもの、両者の発現が低下しているものに分類し、BRAF変異の有無、臨床ステージ分類、免疫チェックポイント阻害薬に対する感受性との相関を調べる。
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| Causes of Carryover |
年度末に抗体を注文したが、納品が年度内に間に合わなかった。
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