2018 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the immediate suppression mechanism of steroid pulse therapy mediated by innate immune cells
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18K08308
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
高橋 良 杏林大学, 医学部, 講師 (00317091)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ステロイドパルス療法 / 自然免疫細胞 / 炎症反応抑制 / 制御性T細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、研究協力者である杏林大学医学部皮膚科学教室の大山学教授、佐藤洋平医師の協力の元、本学附属病院皮膚科において受診されたステロイドパルス療法（パルス療法）を施行した円形脱毛症例患者及び重症薬疹のスティーブンスジョンソン症候群患者より採血を行い、末梢血単核細胞（PBMC）及び血清の採取及び保存を、パルス療法を行う前、パルス療法終了日、そして施行1ヶ月後の3ポイントで行った。患者の来院の都合上、全ての症例で3ポイントを集めることは出来なかったが、30症例以上を集積できた。
集積された症例を用いて、末梢血液中の単球系細胞におけるCD14及びCD16の発現をフローサイトメトリーで解析した。パルス療法終了時には、予備実験でも確認されたCD14dimCD16+ proinflammatory monocyteが消失し、CD14+CD16- classical monocyte （cMO）の単一の細胞集団になることを改めて確認することができた。
次に、単球系の細胞膜に発現しているlectin-like transcript-1（LLT1）がCD8+ T細胞やNK細胞膜に発現しているCD161（NKR-P1A）と結合することによって、CD8T/NK細胞活性が抑制されることから、両者の発現をパルス療法前後で比較してみたところ、単球のLLT1の発現はあまり変化が見られなかったが、CD8+T細胞のCD161の発現が、パルス療法後に増加している所見が見られた。すなわち、CD8+T細胞のCD161発現が増加することにより、単球系細胞によってCD8+T細胞が直接抑制されている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画は、到達目標を5項目に設定し研究遂行を確実化させる。なお、項目(3)(4)のいずれかが実証できた場合、本申請の一時的な目標は達成したと考えたい。
(1) パルス療法を施行した重症薬疹や重症円形脱毛症患者等から血液の採取と保存を行う。採取は、パルス療法を行う直前・終了日・施行後１ヶ月後とする。(2) パルス療法によるcMOのLLT1発現とCD8+/NK細胞のCD161発現の変化を明らかにする。PBMCを抗体で染色し、単球におけるLLT1発現、CD8+ T/CD56+ NK細胞のCD161発現をフローサイトメトリーで測定する。(3) cMOとCD8+T/NK細胞のインタラクションによる細胞傷害機能が抑制される事を明らかにする。(4) パルス療法によって増加したcMOによって制御性T細胞（Treg）が増加することを明らかにする。(5) 学会発表・論文投稿等の成果発表。
本年度の実績より、パルス療法を行うことにより、CD14dimCD16+ proinflammatory monocyteの消失が発生する共通する特徴的変化を確認できた。さらに新たな知見としてCD8+ T細胞におけるCD161+発現の変化を新たに見出すことができた。到達目標として設定した5項目中、本年度では(1)(2)の２項目を到達することができたことから、概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、「研究実績の概要(1)」の症例の集積を行いつつ、これまで集積できたサンプルの解析を進める（研究実績の概要(2)）。特に、CD８＋T細胞におけるCD161の発現の変化については、解析できた症例数がまだ少ないので、重点を置いて解析を行いたい。
研究実績の概要(3)に示した単球系細胞のLLT1とCD8+T/NK細胞のCD161を介したCD8+T/NK細胞の細胞障害機能を測定するアッセイを立ち上げ、分取した単球とCD8+T/NK細胞を混合培養し、パルス療法後のサンプルで、実際に細胞障害抑制が起こりうるかどうかを実験する。さらに、anti-LLT1, anti-CD161抗体をアッセイに添加したブロッキング実験を行い、LLT1/CD161を介した経路であることを実証する。
Treg細胞については、パルス療法を行って著しくTreg細胞が増加した症例とそうではない症例から末梢血を採取することができた。これらの症例の単球系細胞とTreg細胞を解析することにより、パルス療法によってどのようにTreg細胞が増加したのかを調査したい（研究実績の概要(4)）。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由：研究試薬を新たに購入する必要が無かったため。
使用計画：本年度で必要になる抗体等の高額な薬品及び培養器具の購入費用、並びに国際学会に参加し研究者との情報交換の為の旅費として使用予定である。
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