CRISPR screening for identification of molecular targets of T/NK cell lymphomas

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08313
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 中川 雅夫 北海道大学, 医学研究院, 助教 (80435859)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: T/NK細胞リンパ腫 / CRISPRスクリーニング / 分子標的治療

Outline of Annual Research Achievements

（１）スクリーニング可能な細胞株の作成
様々なT/NK細胞リンパ腫病型から樹立された細胞株に対してCas9ヌクレアーゼを導入し、最終的に4病型10種類の細胞樹立に成功した。これらの細胞で標的遺伝子を極めて高確率にノックアウトできることを確認できた。これにより19,114遺伝子を標的とするCRISPRスクリーニングを施行する本研究の基盤が整った。
（２）CRISPRスクリーニングの実行
Cas9ヌクレアーゼを導入したT/NK細胞リンパ腫細胞株５種類に対し、19,114遺伝子に対して76,441sgRNAが含まれたレンチウイルスsgRNAライブラリーを感染させ、28日間の継代培養を経た細胞からゲノムDNAを抽出した。感染直後の細胞からのゲノムDNA と共に、レンチウイルスゲノム配列に特異的なPCRプライマーを用いてsgRNA配列をPCR増幅したものを、次世代シークエンサーNEXTseq500でシークエンシングした。感染直後と比較して28日間の継代培養の間に細胞数を有意に減少させたsgRNAを網羅的に同定し、治療標的候補遺伝子リストを作成することができた。その中には他疾患に対する治療薬として保険適応となっている薬剤や、治験中の薬剤の標的遺伝子も含まれていることを見出した。いくつかの遺伝子については確認実験が進行中であり、スクリーニングの結果を裏付けるデータが得られている。遺伝子ノックアウトによる細胞内の変化についても解析を進めている。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

研究２項目ともに進展がみられた。4病型10種類のCas9ヌクレアーゼ導入細胞を樹立でき、本研究の基盤を確立した点が高く評価できる。さらに、この半数の細胞においてCRISPRスクリーニングを実行できている。得られた治療標的候補遺伝子リストを見る限りスクリーニングは正しく機能しており、確認実験も順調に進行している。

Strategy for Future Research Activity

スクリーニング可能な細胞株の作成がほぼ完成できたことから、今後はさらにCRISPRスクリーニングの実行・解析を進める予定である。また得られた治療標的候補遺伝子リストには既に阻害剤が存在するものが含まれていたので、その薬剤の有効性について検討を進める。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Fox Chase Cancer Center/National Institutes of Health(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: Fox Chase Cancer Center/National Institutes of Health
• [Journal Article] Targeting the HTLV-I-Regulated BATF3/IRF4 Transcriptional Network in Adult T Cell Leukemia/Lymphoma (2018)
  • Author(s): Nakagawa M, Shaffer AL, Ceribelli M, Zhang M, Wright G, Huang DW, Xiao W, Powell J, Petrus MN, Yang Y, Phelan JD, Kohlhammer H, Dubois SP, Yoo HM, Bachy E, Webster DE, Yang Y,Xu W, Yu X, Zhao H, Bryant BR, Shimono J, Ishio T, Maeda M, Green PL, Waldmann TA , Staudt LM.
  • Journal Title: Cancer Cell Volume: 34 Pages: 286～297.e10
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2018.06.014
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The association between the incidence of intestinal graft-vs-host disease and antibiotic use after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (2018)
  • Author(s): Hidaka Daisuke、Hayase Eiko、Shiratori Souichi、Hasegawa Yuta、Ishio Takashi、Tateno Takahiro、Okada Kohei、Goto Hideki、Sugita Junichi、Onozawa Masahiro、Nakagawa Masao、Kahata Kaoru、Endo Tomoyuki、Hashimoto Daigo、Teshima Takanori
  • Journal Title: Clinical Transplantation Volume: 32 Pages: e13361～e13361
  • DOI: 10.1111/ctr.13361
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma (2018)
  • Author(s): Phelan JD, Young RM, Webster DE, Roulland S, Wright GW, Kasbekar M, Shaffer AL, Ceribelli M, Wang JQ, Schmitz R, Nakagawa M, Bachy E, Huang DW, Ji Y, Chen L, Yang Y, Zhao H, Yu X, Xu W, Palisoc MM et al.
  • Journal Title: Nature Volume: 560 Pages: 387～391
  • DOI: 10.1038/s41586-018-0290-0
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of a Fluorescence in Situ Hybridization Probe for Detecting IKZF1 Deletion Mutations in Patients with Acute Lymphoblastic Leukemia (2018)
  • Author(s): Hashiguchi Junichi、Onozawa Masahiro、Oguri Satoshi、Fujisawa Shinichi、Tsuji Masahisa、Okada Kohei、Nakagawa Masao、Hashimoto Daigo、Kahata Kaoru、Kondo Takeshi、Shimizu Chikara、Teshima Takanori
  • Journal Title: The Journal of Molecular Diagnostics Volume: 20 Pages: 446～454
  • DOI: 10.1016/j.jmoldx.2018.02.005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hematogones Predict Better Outcome in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation Irrespective of Graft Sources (2018)
  • Author(s): Ishio Takashi、Sugita Junichi、Tateno Takahiro、Hidaka Daisuke、Hayase Eiko、Shiratori Souichi、Okada Kohei、Goto Hideki、Onozawa Masahiro、Nakagawa Masao、Hashimoto Daigo、Kahata Kaoru、Fujimoto Katsuya、Endo Tomoyuki、Kondo Takeshi、Teshima Takanori
  • Journal Title: Biology of Blood and Marrow Transplantation Volume: 24 Pages: 1990～1996
  • DOI: 10.1016/j.bbmt.2018.06.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel heterozygous ITGB3 p.T720del inducing spontaneous activation of integrin αIIbβ3 in autosomal dominant macrothrombocytopenia with aggregation dysfunction (2018)
  • Author(s): Miyashita Naohiro、Onozawa Masahiro、Hayasaka Koji、Yamada Takahiro、Migita Ohsuke、Hata Kenichiro、Okada Kohei、Goto Hideki、Nakagawa Masao、Hashimoto Daigo、Kahata Kaoru、Kondo Takeshi、Kunishima Shinji、Teshima Takanori
  • Journal Title: Annals of Hematology Volume: 97 Pages: 629～640
  • DOI: 10.1007/s00277-017-3214-4
  • Peer Reviewed
• [Presentation] "Targeting the HTLV-I-regulated BATF3/IRF4 Transcriptional Network in Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma" (2019)
  • Author(s): Nakagawa M.
  • Organizer: "The 34th Nagoya International Cancer Treatment Symposium"
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular mechanisms of HBZ for ATLL cell proliferation (2018)
  • Author(s): Nakagawa M, Endo T, Teshima T, Waldmann TA, Staudt LM
  • Organizer: The 28th annual Meeting of the Japanese Association for Antiviral Therapy
• [Presentation] Critical roles of BATF3/IRF4 in PTCL pathogenesis (2018)
  • Author(s): Nakagawa M.
  • Organizer: The 58th Annual Meeting of the Japanese Society for Lymphoreticular Tissue Research.
  • Invited
• [Presentation] Recent advances of molecular pathogenesis of B-cell lymphomas (2018)
  • Author(s): Nakagawa M.
  • Organizer: The 77th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] PTCL におけるBATF3/IRF4 (2018)
  • Author(s): Nakagawa M.
  • Organizer: 第4 回リンパ腫分子病態研究会 沖縄シンポジウム
  • Invited
• [Remarks] 北海道大学大学院 医学研究院 血液内科 リンパ系腫瘍研究グループ
  • URL: http://www.hokudai-hematology.jp/medical/basic-research/index3.html