2020 Fiscal Year Research-status Report
ヒト赤芽球におけるオルガネラリロケーションの統括的制御機構の解明
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18K08315
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| Research Institution | Akita University |
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Principal Investigator |
小松 久美 (鵜生川久美) 秋田大学, 医学系研究科, 講師 (70646554)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 直人 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (80344753)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒト赤芽球 / 脱核 / Cdc42 / CASIN（阻害剤） |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒト赤芽球の脱核を不均等な細胞質分裂の一種と考え、脱核に至る細胞極性化と収縮環形成を統括的に制御するシグナルや情報伝達経路を明らかにすることを目的としている。特に、ヒト赤芽球脱核はCdc42阻害剤であるCASINによって抑制されることから、脱核時のCdc42の役割や他の分子との相互作用を明らかにすることとした。令和2年度の実績を以下に示す。
1. 平成３０年度の実施状況報告書において、「CASIN投与がCFU-Eの分化に影響しないことを確認した。」としていたものを、再検討した。CD71をヒストグラムにより解析したところ、CASIN投与はCFU-Eの分化をわずかに阻害していた。一方、赤芽球の分化には影響していなかった。
2.平成３０年度からここまでの研究結果を論文化し、acceptされた(Sci Rep. 10: 11806,2020)。
3. Cdc42やRacの下流分子として同定されている蛋白質であるWAVE2、PAK、WASP、Arp2/3の発現を、ウエスタンブロットにて検討した。WAVE2は、CFU-Eで発現していたが、赤芽球では減少してほぼ検出できなくなった。PAK1はCFU-Eでは強く発現していたが、赤芽球では発現を認めなくなった。PAK2はCFU-Eで弱く発現し、赤芽球では発現していなかった。PAK3はCFU-Eから赤芽球まで、弱いながら同等に発現していた。WASPは、CFU-Eで発現していたが、赤芽球では減少してほぼ検出できなくなった。Arp2/3はday7のCFU-Eでは発現していたが、day9以降急速に発現が低下した。
4. GFPベクターやSiRNAを導入した赤芽球で、脱核の様子を継時的に観察したいと考えた。生細胞のまま脱核を観察すべく共焦点顕微鏡にて条件検討を行ったが、十分に脱核を捉えることに成功していない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1. 予定通りの結果を得られてない実験系もあるが、令和２年度に論文化した。
2. mDia3と他の分子の共染色が難航し、局在観察に遅れが生じている。
3. エレクトロポローション法では、GFPプラスミドベクターで赤芽球への導入効率15％前後が得られ、陽性細胞のみをソートすることに成功しているが、siRNA導入細胞ではコントロールであっても精細胞率、増殖率、脱核率が低下するため、Cdc42含めすべてのノックダウンや標的蛋白導入がまだできていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. エレクトロポローション法での、GFPプラスミドベクター導入について、赤芽球へのダメージを最小にするための条件検討を続けていく。標的蛋白導入細胞については、継時的に脱核までを観察し、増殖、脱核への影響についても検討する。
2. 阻害剤処理による蛋白質の変化を、プロテオミクス解析により網羅的に解析し、新規のCdc42情報伝達経路を同定する。同定した蛋白質の発現や細胞内局在をさらに検討する。
3. 赤芽球におけるCdc42-PI3K経路を、PI3Kの酵素反応生成物であるイノシトールリン酸の分子種を質量分析法により定量的に明らかにする。
4. 赤芽球脱核時期まで蛋白の発現が比較的保たれていたPAK3や、Cdc42下流分子として同定されている蛋白質であるProfilin-1について、その発現を、mRNAおよびウエスタンブロットにて検討し、さらに共焦点顕微鏡で局在も観察する。
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| Causes of Carryover |
理由：物品購入において端数が生じたこと、論文化の時期に実験が滞ったことから、次年度に繰り越しが生じた。
使用計画：今後の推進方策に基づいて実験を進める。予算は抗体、ベクター構築、造血幹細胞の純化等に使用する。
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