2018 Fiscal Year Research-status Report
ヒツジ胎仔造血環境下でのヒトiPS細胞由来造血幹細胞の発生機序の解明とその応用
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18K08337
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
阿部 朋行 自治医科大学, 医学部, 講師 (20610364)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒトiPS細胞 / 造血幹細胞 / 分化 / 動物体内 / 胎仔 / ヒツジ / 再生医学 / 幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨髄や臍帯血を用いた造血幹細胞移植は、がん治療や細胞移植のための有効な治療手段である。造血幹細胞のドナー不足が続く近年、新たな移植細胞源としてiPS細胞の活用が期待されているものの、iPS細胞の造血幹細胞への分化誘導はいまだに難しいのが現状である。このような背景の中で申請者らは、妊娠早期のヒツジ胎仔が免疫寛容を誘導することを利用し、造血発生の場である肝臓内でヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞から造血幹細胞を分化させることに成功した（特願2015-168702）。しかしながら、ヒツジ胎仔肝臓内でのヒト造血幹細胞の産生・分化のメカニズムは明らかにできていない。そこで本研究では、（１）ヒツジ胎仔体内でのヒト中胚葉細胞の動態・変化を明らかにし、ヒツジ造血支持細胞との共培養系を用いて（２）造血幹細胞の産生・分化に寄与する因子を抽出することで、試験管内での造血幹細胞への分化誘導技術の開発を目指す。
初年度は、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞を移植した後でヒツジ胎仔肝臓や骨髄の組織切片を作製し、汎血球マーカーであるCD45、Notch経路活性化のマーカーであるN1ICDに対する抗体を用いて免疫染色を行うことで、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞のヒツジ胎仔体内における動態を解析した。その結果、移植後に移植細胞ではCD45を陽性化し、Notchシグナルが活性化していることを明らかにした。また、造血発生に関与することが推測されるヒツジ胎仔組織として、肝臓、骨髄および血管内皮組織を採取し、支持細胞の初代培養ならびにこれらの不死化に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒツジ胎仔体内でのヒトiPS細胞由来中胚葉細胞の動態解析を目的として、初年度は次の実験を行なった。ヒトiPS細胞を、6日間にわたってサイトカイン添加下でOP9ストローマ細胞と共培養し、妊娠60日齢前後（満期147日齢）のヒツジ胎仔肝臓内に移植した。移植手技は、子宮壁越しに超音波ガイド下で胎仔の肝臓を把握し、細胞を注入する方法である（Abeら, 2014, 2012, 2011, 2009）。移植1週間から2ヶ月後に、ヒツジ胎仔の肝臓および骨髄を採取し、移植前は陰性であった、CD45などの血球マーカーの発現およびN1ICDなどのNotchシグナル伝達経路活性化マーカーを免疫染色で評価し、動態および変化を捉えることを試みた。その結果、移植後に移植細胞ではCD45を陽性化し、Notchシグナルが活性化していることを明らかにした。今後、リンパ球系や赤血球系などの血球系統別マーカーを用いて、分化した細胞をさらに詳しく解析していく。
また、試験管内での分化誘導技術への応用を目指し、共培養系の確立を試みている。造血発生に関与することが推測されるヒツジ胎仔組織由来の造血支持細胞として、肝臓および骨髄からストローマ細胞を、臍帯静脈から血管内皮細胞の培養を試みた。その結果、肝臓および骨髄からストローマ細胞を、臍帯静脈から血管内皮細胞を培養することに成功し、さらに複数株を不死化することに成功した。上記の体内動態の解析で明らかになったマーカーを用い、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞と共培養を行うことで、支持細胞としての有効性を評価していく。
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| Strategy for Future Research Activity |
移植1週間から2ヶ月後に、ヒツジ胎仔の肝臓および骨髄組織を用い、CD45以外のリンパ球系や赤血球系などの血球系統別マーカーによって、移植細胞から産生・分化した細胞について詳しく解析していく。また、移植前は陰性であったCD45およびN1ICDが陽性化・活性化したという結果から、これらのマーカーが下記の共培養系の指標として有効であると考えられる。今後、得られたストローマ細胞株および血管内皮細胞株を用い、ヒトiPS細胞由来の中胚葉細胞と共培養を行うことで、造血系分化誘導のための支持細胞としての有効性を評価していく。
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Research Products
(1 results)
