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2019 Fiscal Year Research-status Report

脱ユビキチン化酵素USP10が司る造血幹細胞維持機構の解明

Research Project

Project/Area Number 18K08340
Research InstitutionKanazawa Medical University

Principal Investigator

樋口 雅也  金沢医科大学, 医学部, 教授 (50334678)

Project Period (FY) 2018-04-01 – 2021-03-31
KeywordsUSP10 / DNA修復 / 造血幹細胞 / 相同組換え修復 / 脱ユビキチン化
Outline of Annual Research Achievements

USP10は造血幹細胞(Hematopoietic Stem cell:HSC)の維持に必須の脱ユビキチン化酵素である。しかしながら、HSCにおいてUSP10が如何なる蛋白を脱ユビキチン化し、どのような分子メカニズムでHSC維持に寄与しているかは不明である。本研究ではUSP10の基質蛋白を同定し、USP10によるHSC維持機構の分子メカニズムを解明することを目的とする。
すでにUSP10結合蛋白としてHistone H1を同定し、USP10 KO MEF細胞ではゼオシンによるDNA2重鎖切断(DSB)の修復が遷延化することを見出している。DNA修復の異常はHSCの枯渇を招くことが明らかとなっており、この経路の異常がUSP10 KOマウスにおける骨髄不全の原因であることが強く示唆された。USP10 KO MEFではエトポシドによるDSB修復(NHEJ経路)は正常に起こり、一方でカンプトテシンによるDSB修復(HR経路)には異常が見られた。さらにカンプトテシン処理後のSister Chromatid Exchange活性がKO MEFで低下していること、およびゼオシンによるDSBはHR経路で修復されることを見出した。以上の現象はヒト大腸癌細胞株HCT116のUSP10ノックダウンでも観察された。これらのことからUSP10はDSB修復経路のうちHR経路において重要であることが示唆された。続いてHR活性を直接測定できるDR-GFPレポーター細胞を用いてUSP10の関与を検討した。HCT116 DR-GFP細胞にI-SceIを導入しHR活性を検討した。しかしながら、USP10ノックダウン細胞でのHR活性低下は観察できなかった。このことからUSP10はHRそのものを制御しているわけではなく、DSB修復におけるNHEJとHRの経路選択に関わっていることが示唆された。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

USP10がDSB修復におけるHR経路選択に関わることが明らかとなってきたが、それに関わるUSP10基質分子の同定を含め、その詳しい分子メカニズムを解明するには至っていない。
USP10 コンディショナルKOマウスを用いた解析は、技術補佐員の異動などの実験スタッフ不足のため中断せざるを得ない状況になっている。

Strategy for Future Research Activity

USP10がどのような分子メカニズムでHR経路選択に関わっているかを明らかにする。USP10の基質蛋白を網羅的に同定するため、BioID2を使った近接依存性標識法を新たに導入する。具体的にはUSP10にビオチン化酵素BioID2を融合しUSP10 KO細胞に発現させ、ビオチン化蛋白をLC-MS/MSにより同定する。これらと抗ユビキチン抗体によるプルダウンを組み合わせて、DSB修復過程におけるUSP10基質分子の同定を試みる。BioID2以外にも、TurboID、APEX法なども試みる予定である。

Causes of Carryover

必要となる試薬等が十分にあったため。
令和2年度の物品費に充当する。

  • Research Products

    (1 results)

All 2019

All Presentation (1 results)

  • [Presentation] 脱ユビキチン化酵素USP10によるDNA損傷応答制御2019

    • Author(s)
      宇谷公一、逆井良、岩淵邦芳、樋口雅也
    • Organizer
      第78回日本癌学会学術総会

URL: 

Published: 2021-01-27  

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