2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of immunotherapy against malignancies relapsed post-transplant using TCR-T cells specific for mismatched HLAs
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18K08341
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
赤塚 美樹 名古屋大学, 医学系研究科, 特任教授 (70333391)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 同種造血細胞移植 / 養子免疫療法 / HLA-DP / アロ抗原 / 造血器悪性腫瘍 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2018年度に不適合HLA-DP特異的T細胞の誘導のための培養条件を検討した。2019年度の計画は、(1)実際に同種造血幹細胞移植を受ける予定の患者の移植前末梢血から標的となるB細胞株（B-LCL）を作成すること、(2)移植前および移植後の30日目、100日目に末梢血単核球細胞を採取し、生着するドナー由来T細胞の中で患者と不適合なHLA-DP抗原に反応するT細胞を増殖させ、クローン化することであった。また昨年度の検討からCD4陽性T細胞クローンの細胞障害活性のkineticsはCD8陽性クローンと異なることが分かり、数日間にわたって評価する系の確立も実施した。標的細胞をCFSEで染色した場合は標的細胞の増殖で蛍光減衰が著しく測定が困難であっため、いくつかの蛍光標識法を検討しCytoTell試薬にて最大5日間評価が可能であることを見いだした。次いで経時的な評価時点で細胞の生死判定蛍光試薬を添加し、フローサイトメトリーでCytoTell陽性かつ死細胞の割合を測定し細胞障害活性が適切に評価できるようになった。T細胞受容体（TCR）遺伝子導入T細胞誘導に必要なベクターについてはレトロウイルスベクターを基本骨格とし、サイトメガロウイルス抗原特異的T細胞のTCRをモデルとしてα鎖・β鎖のアミノ酸置換を行い、wild typeのTCRより3倍程度の発現改善が得られた。移植患者のリクルートについては4施設の研究参加が得られたが、同胞間同種移植ではHLA-DP不適合が少ないためバンクを通じた非血縁者間移植症例を対象に限定した。その結果2019年度では参加同意が2例しか得られず、現在移植前末梢血単核球の保存およびB-LCLの誘導および移植後30日目の採血が得られ、HLA-DP特異的T細胞株の誘導を開始したところである。次年度はT細胞のクローニングと機能解析、TCR遺伝子の取得を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究協力施設として4施設の参加を頂いたが、HLA-DP不適合が起こりやすくかつHLAクラスIは適合したような非血縁者間同種移植に対象を限定した結果、非血縁者間移植の半数を占める臍帯血移植例を除外することとなり、日本骨髄バンクからの移植症例に全て依存することになった。ドナーのHLA-DPタイピングを事前にできないことから移植を終了し生着した血液でタイピングを行って不適合を確認する方法に研究計画を変更したため倫理審査に時間を要した。2019年末になってようやくリクルートを開始できたので、遅れを挽回できると考えている。この間CD4陽性T細胞クローンに固有な機能評価法を確定でき、TCR遺伝子改変T細胞作成に必要なベクターの開発を進めることができたため、良好なクローンを樹立次第TCR-T細胞を作成しその機能評価も可能になると思われる。ただし多くの研究協力病院はCOVID-19への対応のため移植症例を減らさざるをえなくなる可能性があり、臨床検体をもとに実施する本研究では不確定要素となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
大幅に遅れているが研究方針について当初からの変更はない。過去2年間の研究で、HLA-DP特異的T細胞誘導条件は確立でき、また移植患者の試料採取の目処も立ったため、患者体内で不適合HLA-DPに生理的環境下にて感作されたドナー由来T細胞を用いて良好なクローンの樹立を進める。抗原遺伝子の同定が詳細な機能解析に必要であるが、既に準備のあるK562細胞株由来のcDNAライブラリーに加えて、CRSPR/Cas9を利用したライブラリーも作成予定であり、2方法で抗原同定を行っていく。
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