2019 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of molecular mechanism by which PBK contributes to tumorigenesis in myeloma cells
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18K08342
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
太田 明伸 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30438048)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武井 則雄 北海道大学, 医学研究院, 助教 (50523461)
花村 一朗 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70440740)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 多発性骨髄腫 / 造腫瘍性 / PBK / トランスレーショナルリサーチ / ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、PBZ binding kinase（以下、PBK）が多発性骨髄腫（Multiple Myeloma、以下MM）細胞において活性化していることを見出した。
PBKの発現レベルとMM患者の生存期間が逆相関を示すことから、MM病態へのPBKの関与が示唆された。そこで、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集法によりPBKの主要なアレル型（N107）、稀なアレル型（N107S）、喪失型（PBK-KO）の各クローンを樹立して、免疫不全マウスを用いたXenograft法により造腫瘍性を検討した。その結果、腫瘍形成能は、N107が最も高く、N107Sではやや抑制されたものの有意な差は見られなかった。また興味深いことに、PBK-KOでは腫瘍形成能が完全に失われた。
そこで、PBKがどのように造腫瘍性に関わるのかを分子生物学的な手法によって検討した。AnnexinV (AxV)/Propidium iodide（PI）二重染色法やウェスタンブロット法によって、アポトーシス解析をおこなったところ、PBK-KO細胞では野生型細胞に比べてアポトーシス細胞の有意な増加や、細胞内のアポトーシス促進因子であるCleaved Caspase-3の活性化を認めた。以上の結果から、PBKはMM細胞のアポトーシスを抑制し造腫瘍性に寄与している可能性が示唆された。
また、臓器または個体の成熟過程におけるPBK喪失の影響を調べるために、CRISPR/Cas9システムによるゲノム編集を用いたPBK遺伝子破壊マウス（PBK-KOマウス）の樹立を試みた。その結果、PBKの遺伝子座のフレームシフト変異を有する遺伝子破壊個体の作出に成功した。現在、分担研究者がPBK-KOマウスにおける生化学的な性状解析を進めており、今後は表現型の解析をおこなう予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画にあったMM細胞株を用いた主要な実験（分子機序、薬剤感受性、分子標的剤を用いた治療実験）は、概ね終了した。また、得られたデータを収集・解析し、論文の投稿を準備中である。論文の公表は、オープンアクセス可能な雑誌とし、公表時にプレスリリースを予定している。
遺伝子破壊マウスの作出においても進展が見られた。分担研究者は遺伝子編集技術を用いて、PBKのExon3を標的としたストラテジーによってPBKの両アレルにフレームシフト変異を持つ遺伝子破壊個体を見出した。現在、当該個体に戻し交配を試みており、今後は生化学的手法を用いた表現型の解析をおこなっていくことが可能となる。
しかし、ノックアウトマウスの解析においては、生育不全や耐性致死などの予期せぬ変化が観察されることもあり、マウスの生育状況によっては解析に時間を要する可能性がある。
以上より、本研究はおおむね当初の予定に沿って進行していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究代表者は、MMにおけるPBKの機能解析の過程において、PBKの発現と密接な相関を示すシグナル伝達経路と新規遺伝子を発見した。今後は、MMの悪性化機構の更なる解明に向け、PBKの分子間ネットワークの解析をおこない、新たな創薬へとつなげていく方針である。
最近、LinらはPBK阻害剤であるOTS514がPBKのみならずCDK11の活性を阻害することを報告した（Lin et al, Science Advances, 2019）。この論文は、OTS514のがん治療薬としての可能性を否定する結果を示したものではないが、OTS514によるキナーゼ阻害作用は必ずしもPBK特異的ではないことを示唆している。そこで、研究代表者は、OTS514よりも特異性に優れたPBK阻害剤の開発に向けたライブラリースクリーニングアッセイの開発を検討中である。
また、本年度は分担研究者と共にPBK遺伝子破壊マウスを用いた表現型の解析を中心に行い、正常個体におけるPBKの発現分布を明らかにする予定である。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じたのは、分担研究者の異動に伴い、当初の研究計画に若干の遅れが発生したことによるものである。研究計画の実施については滞りなく進行しており、当初予定していた2019年度の動物実験を用いた解析を本年度に繰り下げて行う予定としている。
本年度の研究費の主な用途として、①オープンアクセス誌への論文出版にかかる論文校閲費（謝金）や論文掲載費、②国際学会での学会発表に加えて、③当初の実験計画と昨年度に予定されていた遺伝子破壊マウスの個体数の維持と当該マウスを用いた表現型解析があげられる。
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[Journal Article] Bi-allelic loss of FAM46C triggers tumor growth with concomitant activation of Akt signaling in multiple myeloma cells2020
Author(s)
Kanasugi J, Hanamura I, Ota A, Karnan S, Vu LQ, Mizuno S, Wahiduzzaman M, Rahman ML, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y, Takami A
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Journal Title
Cancer Science
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Chromosomal translocation t(11;14) and p53 deletion in B cell-derived iPS cells by CRISPR/Cas92019
Author(s)
Aki Yanagi, Naohiro Tsuyama, Misaki Sugai, Yu Abe, Yukari Yanai, Akinobu Ota, Karnan Sivasundaram, Lobna Alkebsi, Moe Muramatsu, Tomonari Shigemura, Megumi Sasatani, Yuko Hashimoto, Kenji Kamiya, Ichiro Hanamura, Takayuki Ikezoe, Masafumi Onodera, Akira Sakai.
Organizer
第81回日本血液学会学術集会
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[Presentation] Introduction of Chromosomal Translocation t(11; 14) and a p53 Deletion into Normal B Cell-derived iPSCs to Elucidate the Cellular Origin of Myeloma Cells.2019
Author(s)
Yanagi A, Tsuyama N, Sugai M, Abe Y, Azami Y, Yanai Y, Ota A, Sivasundaram K, Muramatsu M, Shigemura T, Sasatani M, Hashimot Y, Kamiya K, Hanamura I, Ikezoe T, Onodera M, Sakai A.
Organizer
61th ASH Annual Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Identification of Genome-wide Molecular Characteristics in Ameloblastoma:Role of Tlr2 in Ameloblastoma Cells2019
Author(s)
S.Kondo, A.Ota, T.Ono, S.Karnan, M.Wahiduzzaman, T.Hyodo, M.L.Rahman, K.Ito, A.Furuhashi, T.Hayashi, H.Konishi, S.Tuzuki, Y.Hosokawa, Y.Kazaoka
Organizer
ASCB/EMBO 2019 Meeting
Int'l Joint Research
