若年性骨髄単球性白血病に対する改変T細胞と分子標的薬による複合治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08350
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 松田 和之 信州大学, 学術研究院保健学系, 教授 (00647084)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中沢 洋三 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (60397312)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 若年性骨髄単球性白血病 / GMR-CAR-T細胞 / iPS細胞 / 分子標的薬

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、希少がんで細胞株が存在しない若年性骨髄単球性白血病（JMML ）について、JMMLから樹立したiPS細胞を用いて、GM-CSF受容体（GMR）に対するキメラ抗原受容体（CAR）を発現させた遺伝子改変T細胞（GMR-CAR-T細胞）と分子標的薬との複合治療によるJMMLの治療モデルを構築することである。
平成30年度の研究成果として、JMMLで詳細な抗腫瘍効果が検証されていないc-met阻害剤クリゾチニブ、PI3K阻害剤イデラリシブについて、抗腫瘍効果をJMML患者由来iPS細胞から分化したCD34陽性細胞を用いてメソカルトを用いたコロニー形成法により検証することが出来た。JMML由来iPS細胞は、PTPN11遺伝子の変異c.226G>Aが陽性および陰性の2種類のiPS細胞を用いた。血球分化誘導はBMP4, SCF, TPO, VEGFを同時添加し行った。メソカルトを用いたコロニー形成法は、分化誘導した血球細胞から磁気分離により回収したCD34陽性細胞とメソカルト（GM-CSF含）、各薬剤を混和して14日間培養した後、％コロニー形成能を計算した。その結果、PTPN11変異陰性CD34陽性細胞とPTPN11変異陽性CD34陽性細胞の％コロニー形成能はクリゾチニブで、25.6％と10.7％、イデラリシブで30.8％と14.6％であることが分かった。
平成30年度の研究成果であるイデラリシブとクリゾチニブがPTPN11変異陽性細胞に対してより高い抗腫瘍効果を示すこと、及びPTPN11変異陰性細胞でも％コロニー形成能の減少が認められることを明らかにしたことは、特異的かつ有効な至適濃度を選定する必要性を示唆するという点で意義が大きいと考える。今後、GMR-CAR-T細胞との複合治療を構築するためにも重要な知見であると考える。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GMR-CAR-T細胞と分子標的薬との複合治療によるJMMLの治療モデルを構築するという最終目的に向けて、まず、JMMLで詳細な抗腫瘍効果が検証されていない新規の薬剤（c-met阻害剤クリゾチニブ、PI3K阻害剤イデラリシブ）についてiPS細胞由来分化細胞を用いて、その抗腫瘍効果を検証することが出来た。CAR-T細胞との複合治療においては、より多くの薬剤を検証する必要性があるため、候補薬剤を増やすために、新規薬剤のJMML細胞に対する抗腫瘍効果の検証を優先して実施した。当初の計画であったGMR-CAR-T細胞の生存への影響を最小限にする薬剤濃度の決定について、平成30年度に実施した検証から明らかになったPTPN11変異陰性細胞でも％コロニー形成能の減少が認められるという知見から、正常細胞への薬剤濃度を選定している段階であるため、やや遅れていると判断している。次項の研究推進方策に従い、検討を進めていきたい。

Strategy for Future Research Activity

まず、GMR-CAR-T細胞の生存への影響を最小限にする薬剤濃度の決定を行うため、平成30年度の研究成果に基づいて薬剤濃度を決定する。具体的な薬剤濃度の決定は、GMR-CAR-T細胞と設定した濃度の薬剤を混和して培養しトリパンブルーを用いて生細胞数をカウントして評価する。その際には、昨年同様にJMML由来iPS細胞から分化誘導したCD34陽性細胞も使用し、遺伝子変異陽性CD34陽性細胞に、より特異的に作用し、GMR-CAR-T細胞の生存には影響が最小限になる薬剤濃度の決定を行う。その後、複合治療の効果を検証するため、GMR-CAR-T細胞とJMML由来iPS細胞より分化誘導したCD34陽性細胞を混合培養し、各濃度の分子標的薬を添加する。培養後、トリパンブルーを用いて生細胞数をカウントする。さらに、抗CD3抗体や抗CD34抗体と抗CD38抗体を用いたフローサイトメトリーによりGMR-CAR-T細胞への影響や抗腫瘍効果を解析する。また、混合比を1:1から1:4でメソカルトを用いて培養を行い、GM、Erythroidコロニー数をカウントし、抗腫瘍効果の評価を行う予定である。

Causes of Carryover

[次年度使用額が生じた理由]今年度の研究費の主な使用用途としては、iPS細胞の維持培養に必要な試薬と薬剤等の購入であった。当初の計画では、GMR-CAR-T細胞の生存への影響を最小限にする薬剤濃度の決定までを実験計画としていたが、最終目的であるGMR-CAR-T細胞と分子標的薬による複合治療を開発するためには、候補薬剤をより多く用いる必要性があった。そのためJMMLに対する抗腫瘍効果の検証がなされていない新規薬剤であるクリゾチニブとイデラリシブの抗腫瘍効果の検証に必要な試薬購入に研究費を使用し、また、その検証に時間を要した。そのため、GMR-CAR-T細胞の生存への影響について、影響を最小限にする薬剤濃度を選定している段階であり、GMR-CAR-T細胞の作製・維持培養などが行えなかったため、当初の計画に計上した額との差額が生じた。
[使用計画]次年度使用額は平成31年度請求額と合わせて、GMR-CAR-T細胞の生存への影響を最小限にする薬剤濃度を検討し、遺伝子変異陽性CD34陽性細胞に、より特異的に作用し、GMR-CAR-T細胞の生存には影響が最小限になる薬剤濃度の決定を行う実験および複合治療の開発を目的として、GMR-CAR-T細胞とJMML由来iPS細胞より分化誘導したCD34陽性細胞を混合培養して、抗腫瘍効果を検証する実験に使用する予定である。