絶対的遺伝子発現解析による造血幹細胞・ニッチ間分子コミュニケーションの全貌の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08377
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 清田 純 国立研究開発法人理化学研究所, 科技ハブ産連本部, チームリーダー (40793790)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 遺伝子発現 / 造血幹細胞 / ニッチ / 分子コミュニケーション

Outline of Annual Research Achievements

2018年度に引き続き、2019年度も遺伝子解析方法をsingle cell RNA-seqへと変更するため主に測定プロトコールの実装と最適化に取り組んだ。具体的にはプロトコール策定の完了したSmart-seq法に準拠したsingle-cell RNA-seq手法に対して、テスト細胞を用いた手順の最適化と性能の評価を徹底的に行った。1回のsingle-cell RNA-seqに対して、Fluorescense-activated cell sortingのclone-sortによる1細胞の分取、96チャンネルキャピラリー式cDNA定量装置によるRT-PCR産物の定量、ナノリットル・リキッドハンドリングロボットによるサンプル濃度の平準化とタグメンテーション、次世代シーケンサーによるcDNA配列の解析など多数の大型機器を使用するため、その作業は困難を極めたが年度末には安定して設計通りの性能を出せるようになった。
また次世代シーケンサーから出力される膨大なシーケンスデータの解析に対しても、ソフトウェアの開発を行い、生データの品質の評価、レファレンスゲノムへのマッピング、遺伝子発現情報へのデータ標準化、遺伝子発現情報の高次解析などの手法を整え、single-cell RNA-seqパイプラインを完成させた。現在、1細胞から約11000種類の遺伝子の発現を定量的に検出することに成功しており、これは世界的に見ても最高水準のsingle-cell RNA-seq手法の実装であると言える。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上記、研究実績の概要に記した進捗の結果、1細胞から平均11000遺伝子の発現を定量的かつ安定的に検出することに成功しており、これは現在一般に用いられている手法が約3000遺伝子しか検出できないことと比べて、極めて精度の高い1細胞遺伝子発現解析を行うことが出来ることを示している。

Strategy for Future Research Activity

1細胞RAN-seqの測定パイプラインが完成したので、2020年度は予定の細胞種に対するRNA-seqを施行する予定である。これにより極めてヘテロな骨髄内に存在する様々な細胞の遺伝子発現状態を網羅的に解析し、細胞間コミュニケーションのモデルを構築する。

Causes of Carryover

COVID-19の影響により年度末に向け実験・出張のアクティビティが低下したため。次年度の実験・出張に充当する。