キチナーゼによるダニアレルギー誘発機構の解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08395
• Research Institution: Kyorin University
• Principal Investigator: 新江 賢 杏林大学, 保健学部, 講師 (50306669)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: キチン / アレルギー

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、マウスにおいて、タンパク質抗原単独ではアレルギーは誘導されないが、ダニ外殻の主要な構成成分である「キチン(Chitin)」と共に吸入すると、アレルギー応答が誘導されることを見出した。キチンを含むダニの死骸や糞がアレルギー喘息の原因であることが知られており、キチンは新規のダニアレルギー誘発物質であると考えられる。しかしながら、キチン受容体やシグナル伝達機構といったキチンによるアレルギー応答誘発機構の詳細は不明である。申請者はこれまでに、この機構に関与しうる分子としてキチナーゼファミリー分子をマウス肺より同定している。本分子は、キチンによる樹状細胞の活性化に関与することから、キチンによるダニアレルギーの誘発に関与している可能性がある。そこで、本申請では、ダニアレルギーの発症機構の解明を目的として、以下の点について明らかにする。
1)キチンによる気道炎症誘導機構の解明　キチンによる気道炎症に関わるメディエーターや細胞が、キチンによるアレルギー誘導に関与することが推測される。
2) キチナーゼファミリー分子の産生細胞・産生機序の解明　キチナーゼファミリー分子の産生細胞・産生機序がキチンによるアレルギー誘導に関わると同時に、ダニアレルギーの感受性を決める要因の一つであるかもしれない。
3) キチナーゼファミリー分子の遺伝子欠損マウスの作成とその解析　キチナーゼファミリー分子の生体内における役割を明確にする。
4)キチンによるシグナル伝達に関わる分子の解明を目指す。　受容体をはじめ、キチンのシグナル伝達機構はほとんど明らかとなっていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1) キチンによる気道炎症誘導機構の解明　キチン吸入による気道炎症は、不溶性キチンの粒子サイズが大きくなるほど強くなることを明らかとしている。さらに、IL-1KOマウスを用いた検討により、この不溶性キチン粒子による気道炎症にはIL-1関与することが明らかとなっている。さらに今回、この炎症には、獲得免疫系細胞やマスト細胞は無関係で3型自然リンパ球（ILC3）の関与が示唆されている。
2) キチナーゼファミリー分子の産生細胞・産生機序の解明　キチナーゼファミリー分子は、マウスの肺胞上皮細胞、細気管支の気道上皮細胞、白血球等に発現していることが、免疫組織化学的検討より明らかとなっている。しかしながら、市販の抗体を用いたFACSではキチナーゼファミリー分子を検出できず、発現細胞の詳細な検討が難しい。そこで、キチンを吸入させたマウス肺についてのSingle cell RNA-seq解析を検討している。
3) キチナーゼファミリー分子の遺伝子欠損マウスの作成とその解析　CRISPR/Cas9システムを用いて、これまでに4匹の欠損マウスが得られている。現在、4回目のバッククロス中である。
4)キチンによるシグナル伝達に関わる分子の解明　キチン刺激によりTNF-aを産生する細胞株が明らかとなっている。そこで、この細胞にNF-kBプロモーターの下流にGFP遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した。しかしながら、GFPの発現量が非常に低くその後の検討には不適当であった。そこで、CRSPR/Cas9システムを用いて、TNF-a遺伝子をGFPに置換した細胞株を樹立した。今後は、これらのクローンを用いて、キチンのシグナル伝達に関与する分子をスクリーニングする。

Strategy for Future Research Activity

1) キチンによる気道炎症のメディエーターの解明　今後、その他のメディエーターや細胞を明らかにする。
2) キチナーゼファミリー分子の産生細胞・産生機序の解明　今後、ingle cell RNA-seq解析により、キチナーゼファミリー分子の産生細胞の同定を進めていく。
3) キチナーゼファミリー分子の遺伝子欠損マウスの作成とその解析　今後は、仔が生まれたらヘテロ同士の交配を実施し、KOマウスが生まれたら実験を開始する。
4) キチンによるシグナル伝達に関わる分子の解明　今後、TNF-a遺伝子がGFP遺伝子に置換された細胞株にCRSPR/Cas9ライブラリーによる遺伝子変異を導入し、その後のキチン刺激でGFP発現が低下したクローンについてDNAシークエンスを実施する。

Causes of Carryover

研究の進捗がやや遅れているため。
次年度には予定通り使用予定である。

Research Products

• [Journal Article] Induction of human regulatory innate lymphoid cells from group 2 innate lymphoid cells by retinoic acid (2019)
  • Author(s): Morita H, Kubo T, Rukert B, Ravindran A, Soyka MB, Rinaldi AO, Sugita K, Wawrzyniak M, Wawrzyniak P, Motomura K, Tamari M, Orimo K, Okada N, Arae K, Saito K, Altunbulakli C, Castro-Giner F, Tan G, Neumann A, Sudo K, O'Mahony L, Honda K, Nakae S, Saito H, Mjosberg J, Nilsson G, Matsumoto K, Akdis M, Akdis CA
  • Journal Title: Journal of Allergy and Clinical Immunology Volume: 143 Pages: 2190～2201.e9
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2018.12.1018
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research