Development of differential diagnostics for various arboviruses

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08434
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 井上 真吾 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (00346925)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: エピトープブロッキングELISA / 黄熱ウイルス / デングウイルス / モノクローナル抗体 / 大腸菌タンパク発現系 / エンベロープ蛋白 / NS1蛋白

Outline of Annual Research Achievements

2019年度は2018年度に引き続きフラビウイルス科ウイルスによる黄熱とデング熱を区別できるウイルス特異的IgG検出エピトープブロッキングELISA(競合ELISA)の開発を目指して下記のような4ステップで実験を進めた。【ステップ1】組換えタンパクのデザイン：黄熱ウイルスのエンベロープタンパク（ドメイン1、2および3）を標的タンパクとするモノクロ抗体作出のため、各ドメインのタンパクを発現するプラスミドを構築し、大腸菌タンパク発現系を用いてタンパク発現を行った。【ステップ2】組換えタンパクの発現と精製：産生されたウイルスタンパクをHISタグ標識を利用したカラム精製法にて精製しウエスタンブロット法にて標的タンパクであることを確認した。【ステップ3】モノクローナル抗体の作出と反応性の評価：これらの精製組換えタンパクを用いて作出されたモノクローナル抗体の内2018年度に精製された6クローンに加えて、2019年度に精製された3クローンにより、ドメイン1（3クローン）およびドメイン2（2クローン）、ドメイン領域不明（4クローン）に対するモノクローナル抗体をそろえることができた。黄熱ウイルスを含めた各種フラビウイルスとの反応性および特異性について蛍光抗体法とELISA法を用いて評価し、その特異性を確認した。【ステップ4】診断キットの開発とキットの評価：上記の9クローンの黄熱ウイルス特異的モノクローナル抗体を個別に用いてIgG抗体の測定をエピトープブロッキングELISAが観察できるかどうか試みたところ、1クローンについて強い競合作用を認め、2クローンについては弱い競合作用を認めた。さらには競合作用を観察するためには患者血清中の抗体が0.01～0.1ug/mLの濃度で存在する必要があることが判った。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

2019年度はフラビウイルス科ウイルスの黄熱とデング熱を区別できるウイルス特異的IgG抗体検出エピトープブロッキングELISA（競合ELISA）並びにIgM抗体検出エピトープブロッキングELISAの開発を目指して実験を進めたが、IgG抗体検出エピトープブロッキングELISAのみに留まった。その原因としては、黄熱陽性患者血清が数量ともに非常に限られており、条件の検討実験に十分に使用できなかった点が挙げられる。2019年度の研究成果としては、「１」抗黄熱ウイルスモノクローナル抗体全9クローンの生産および精製が終了し、これらのクローンが全て、黄熱ウイルス特異的であることを確認できたためエピトープブロッキングELISAに応用できる体制が整った。「２」in house黄熱IgG検出エピトープブロッキングELISAを行ったところ、競合による強い阻害効率の値が計測できたクローンが１つ、弱い阻害効率が計測できたクローンが2つあることが判明した。今後さらに抗原、抗体、反応条件等を検討し検出感度を向上させれば、鑑別診断に応用できるものと思われる。そして、複数のクローンの組み合わせにより、より明瞭な阻害効率の値を示すIgG検出エピトープブロッキングELISAを確立できる可能性が出てきた。これらIgG検出エピトープブロッキングELISAの開発において得られた知見はIgM検出エピトープブロッキングELISAの開発にも応用できると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

2020年度は黄熱ウイルスとデングウイルス感染症間の鑑別診断を可能にするIgG検出エピトープブロッキングELISA（競合ELISA）とIgM検出エピトープブロッキングELISAの両方の開発を行い、黄熱とデング熱の両疾患についてIgG抗体価あるいはIgM抗体価から鑑別診断できる方法を確立したい。そのために検討する項目としては、（１）抗エンベロープモノクローナル抗体だけでなく、NS1（非構造タンパク1）に対するモノクローナル抗体を用いてのIgG検出エピトープブロッキングELISA（競合ELISA）についても検討を加える予定である。デング熱においてはNS1蛋白が患者血清中に検出され、NS1蛋白検出ELISA法が診断にも広く用いられているため、それに対する抗体を計測することは非常に有用であることが予想される。黄熱においてもNS1蛋白および抗NS1蛋白抗体が患者血清中に検出されている可能性が高いため、エピトープブロッキングELISAによる検出について検討を加えていく。（２）次に、過去2年間の研究では本ELISAのアッセイ抗原にウイルス完全粒子を用いてきたが、2020年度は組換えタンパクを用い、よりコントラストの明瞭な試験法を開発していく。（３）ケニア共和国およびコンゴ民主共和国の研究者と連携を図り、現地にて黄熱患者およびデング熱患者の検体を用いてIgG検出およびIgM検出エピトープブロッキングELISAによる両疾患の鑑別診断への応用の可能性について評価、検討したい。

Causes of Carryover

2019年度は国内での黄熱ウイルス特異的IgG検出エピトープブロッキングELISAの開発、評価法の検討に時間を費やしてしまったため、予算の2020年度使用が生じてしまった。2020年度前半までに、エンベロープおよびNS1タンパクに対するモノクローナル抗体複数クローンの最適組み合わせを検討して、黄熱およびデング熱に対するIgG検出エピトープブロッキングELISAおよびIgM検出エピトープブロッキングELISAの検査法の開発を終了し、2020年度後半にかけて、ケニア共和国およびコンゴ民主共和国で得られた黄熱およびデング熱患者の血清を用いてこれらの試験法の評価を実施したい。