サイトメガロウイルスの感染細胞指向性をエピジェネティックに型判別する方法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08441
• Research Institution: Fukushima Medical University
• Principal Investigator: 石岡 賢 福島県立医科大学, 医学部, 講師 (50305356)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 生田 和史 東北医科薬科大学, 医学部, 准教授 (60512184)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ヒトサイトメガロウイルス / 臨床分離株 / 細胞指向性 / エピジェネティクス

Outline of Annual Research Achievements

サイトメガロウイルス（CMV）は様々な細胞に感染し多様な症状を引き起こすウイルスであり、妊婦が初感染すると胎児への経胎盤リスクが高く先天性CMV症を引き起こす。我々は先天性CMV感染児の尿から複数の細胞を用いたCMVの分離により、同一個人から細胞指向性(トロピズム)の異なる株を分離することが出来た。この事実は、我々にはトロピズムの異なる複数の CMV 株が感染していて、その異なる株が異なる臓器の疾患を起こしている可能性を示唆している。このトロピズムを決定する要因を決定するべく全ゲノムシークエンシングを試みたが、5名の感染児から得られたトロピズムの異なる株間に塩基配列上の差異を確認出来なかった。
CMVにおいてはヒストンのメチル化や潜伏感染や再活性化に関与することが報告されており、前初期遺伝子のプロモーターのゲノムDNAのメチル化によって遺伝子発現が制御されることも報告されている。これらのことからCMVのトロピズムの違いがゲノムのメチル化やヒストンのメチル化によるものと考え、CMVのエピジェネティック解析を行うことにした。
トロピズムの異なるウイルスゲノムを感染細胞、および培養上清中より回収し前初期遺伝子であるIE2プロモーターの塩基配列をPCRダイレクトシークエンスにより塩基配列を決定したところ同一個人から分離したトロピズムの異なる株間に違いは認められなかった。次にこの領域のゲノムのメチル化の違いを調べるためバイサルファイト法により非メチル化シトシンをウラシルに変換後PCRによる増幅を試みた。その結果、コントロールDNA（IE2プロモーター領域を含むプラスミド）では増幅が確認できたが、ウイルスゲノムでは増幅を確認できなかった。バイサルファイト変換するための試薬やその後のPCRを行うDNAポリメラーゼを複数試行したがいづれも増幅を確認出来ていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

研究開始時はゲノムのバイサルファイト変換後、次世代シークエンサーで網羅的にメチル化領域を解析する予定出会ったが、その前段階でのバイサルファイト後のPCRでのDNA増幅が確認出来ていないためトロピズムを決定する領域の特定に至っていない。コントロールDNAでは成功しているので、回収したウイルスゲノムのバイサルファイト変換時のDNAの損傷や分解が想定以上に大きいと思われる。バイサルファイト変換時のDNAの分解は回避不可能な現象であるため、使用するウイルスゲノムDNA量を増やす必要があるが、CMVは他のヘルペスウイルス科の単純ヘルペスウイルスと比較して増殖速度が遅く、またウイルス力価自体も低いため収量を高める工夫が必要と考える。

Strategy for Future Research Activity

ウイルスゲノムDNAの収量を増やし、引き続きバイサルファイト変換し次世代シークエンサーでのメチル化DNA領域の特定を行っていく。一方で、この方法で解析が難しい場合はメチル化DNA抗体によるクロマチン免疫沈降（ChIPアッセイ）を行い共沈降したDNAのシークエンによりエピジェネティックなトロピズムの違いについて解析して行く予定である。しかしながら、メチル化による遺伝子発現については全か無ではないと想定されるので、そのメチル化の程度は非常に大きな要因となる。そのため、ChIPアッセイと次世代シークエンサーでの解析がどこまでエピジェネティックなトロピズムの違いに迫れる可能性を探って行きたい。

Causes of Carryover

次世代シークエンサー用の試薬を購入予定であったが、試行することが出来なかったため次年度へ繰越すことにした。