2018 Fiscal Year Research-status Report
劇症型感染における起因菌および外毒素の新規迅速分析法の確立
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18K08449
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
上田 たかね 帝京大学, 医学部, 助教 (80459312)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斧 康雄 帝京大学, 医学部, 教授 (10177272)
西田 智 帝京大学, 医学部, 助教 (10409386)
藤崎 竜一 帝京大学, 医療技術学部, 准教授 (00527442)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 細菌毒素 / 感染症 / 迅速分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、電撃性紫斑病Purpura fulminas (PF)や劇症型の感染症を起こす肺炎球菌の病因因子の同定を行い、これを標的とするバイオセンサーを活用した新規迅速・高感度分析法を確立することである。課題採択されたH30年度は本学附属病院にて保存されていたPF発症患者から分離された肺炎球菌２株、肺炎患者からの分離肺炎球菌３株、sepsis患者かたの分離5株ならびに標準株の計11検体の入手と大量培養、全ゲノム解析を行うためのDNA調整を行った。 現在Illuminaでのsequenceは終了しているが、ロングリードのNanopore sequenceを現在解析中である。
肺炎球菌の莢膜抗原は既知の病原因子の１つであり、莢膜抗原の血清型による分類が行われている。培地上に形成されたコロニーを観察しただけでも、株によりムコイド形成状態が異なっており、本研究で解析をしているPFの2株を含む肺炎球菌株の血清型同定をPCRで解析中である。
肺炎球菌は自己融解酵素Autolysin を有しており、培養時間が長すぎると菌体が融解するため菌体回収量の減少および、ゲノム精製が困難となる。特にPF株の増殖率は3~4倍高い結果を得ている。現在 autolysin 遺伝子についても解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
PF発症患者の血液培養分離肺炎球菌2株、sepsis患者からの分離6株、肺炎患者からの分離3株の全ゲノム解析(WGS)を「先進ゲノム支援」の支援を頂きながら解析中である。「先進ゲノム支援」でのWGSはNanopore sequence をメイン、Illumina sequenceを補助的に解析手法とするプロトコールで行っている。H30年12月までにIllumina sequence での解析は終了した。しかし解析拠点（九州大学医学部／九州大学大学院細菌学分野）より
Nanopore sequence がうまくいかないとの連絡を受けた。送付した精製genomic DNA (gDNA) の断片化が多く、ロングリードが難しいとの現状報告と、それに対する改善方法について検討した。gDNA精製の際の溶菌ステップにおいて、グラム陽性菌である肺炎球菌の細胞壁が強固であることから、これまでの溶菌方法では不十分なのではないか、溶菌方法の改善がgDNAのクオリテイアップになるのではないかということになり、従前の精製プロトコールで用いていたLysozyme, Proteinase K に加え、ペプチドグリカン溶解作用を持つMutanolysinを加えての溶菌にプロトコールを変更した。変更プロトコールにより精製したgDNAのPF2株が現在、Nanopore sequence解析中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
精製プロトコール改正後のGWSの結果が5月中に出るとの連絡を受けている。改正プロトコールでのgDNAのクオリテイがNanopore sequence 解析に足るようであれば、他の9株の精製gDNAの解析を行い、病原因子探索を行う。Autolysin や病態に関連する遺伝子発現を解析するためにRNA精製が必要となるが、講座に自動核酸精製装置(QiaCube)が導入されたので、精製などが効率よくいくのではないかと考えている。GWSの最終結果を待たずとも、既知の代表的な病原因子についての遺伝子発現を併行して解析する。
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| Causes of Carryover |
課題申請時において受託でのWGS解析を予定していたが、「先進ゲノム支援」の支援課題に採択されたため、予定の使用額に余剰が発生した。しかしWGSはまだ終了しておらず、2019年度も解析を続けるため、精製用の試薬や消耗品、試料送付費用、先進ゲノム解析支援が主催する解析講習や合同シンポジウムへの参加費（採択者の科研費からの支出が規定されている）等に充てる計画である。
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