2019 Fiscal Year Research-status Report

Evaluation of cellular senescence associated with HBV infection and the effect of anti-HBV nucleic acid analog

Research Project

Project/Area Number	18K08460
Research Institution	National Center for Global Health and Medicine
Principal Investigator	鍬田伸好 (東伸好) 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, 研究所難治性ウイルス感染症研究部, 主任研究員 (60361218)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	抗HBV核酸アナログと細胞老化 / HBV感染と細胞老化 / 老化関連βガラクトシダーゼ / p21
Outline of Annual Research Achievements	令和元年度はこれ迄の実験結果の再現性とメカニズムの解明を行う為にin vitroでの実験継続と共にin vivo評価系での検討を開始した。 In vitro評価系での結果として、HBVを感染させた新鮮ヒト肝細胞(PXB細胞)群では、HBV非感染PXB細胞群に比べ1)SA-βgal活性が低下し、細胞老化マーカーである p21CIP1の核内タンパク量が減少する事; 2)そのSA-βgal活性やp21CIP1の核内タンパク量は、新規核酸アナログCFCPの添加によりHBV非暴露のPXB細胞群と同等のレベルに戻る事を確認した。また種々の核酸アナログがHBV非感染PXB細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に与える影響について、核酸アナログ非添加群に比べて1) PXB細胞では既存の核酸アナログ (ETV・TDF)添加では変化なし、CFCP添加では核内p21CIP1, p27KIP1量が上昇する事; 2) HUVECではTDF・ETV・CFCPの添加で核内のHMGB２量が上昇, CFCPの添加でp21CIP1上昇, ETV・CFCPの添加で p33ING1b, p53は上昇し、p27KIP1は低減する事が明らかになった。更にこれらの発現量はMAPKAPキナーゼ2阻害剤共存で1)HBV暴露PXB細胞やHBV非暴露PXB細胞では影響を受けない事; 2)HUVECでは影響を受け、Ros産生量の変動が見られる一方でDNAダメージ応答関連タンパク発現には影響がない事が分かった。 In vivo評価系での検討では以下３群のヒト肝キメラマウス：1)HBV感染無し・核酸アナログ投与無し; 2)HBV感染有り・核酸アナログ投与無し; 3)HBV感染有り・核酸アナログ投与有り,より採取された肝臓切片サンプルを用い、p21CIP1, 8-OHdG, TGの産生レベルと局在の解析を免疫染色法で試みた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初の計画では、令和元年度に、これ迄の実験結果の再現性とそのメカニズムを検討するための実験を細胞内 signaling pathway阻害剤等を用いてin vitroで進めると共にin vivo評価系での検討を主として免疫染色法を用いて開始する予定であった。上述の様に令和元年度はin vitro評価系の結果として、HBV感染の確立を確認したPXB細胞群において、非感染細胞と比べ: 1)SA-βgal活性 2) p21ｍRNA量およびタンパク発現量 3)テロメアDNA長, において差異が認められ、そのような変化は、現在臨床に供されている抗HBV核酸アナログの投与によって影響を受ける事、また核酸アナログ自体がHBV非感染PXB細およびHUVECに与える影響について、ある種の核酸アナログの添加は、細胞老化関連タンパク発現量を上昇させる事が前年度の結果に一致して再現性をもって確認された。加えてこれらの核酸アナログがHUVEC細胞ではRos産生をもたらしoxidative stressによってp21CIP1 pathwayを介した prematureな細胞老化に関わるメカニズムが推定された。HBV感染PXB細胞、ならびにHBV非感染PXB細胞については、MAPKAPキナーゼ2阻害剤の共存によりp21CIP1 mRNA発現量ならびにRos産生量にHUVECの場合のような変動は認められず、細胞種の違いだけでなく、HBV感染と核酸アナログ添加の影響が密接に関与している可能性が示唆された。一方で、in vivo評価系での検討については感染性のある組織切片を作成することから研究施設の共用機器使用制限、並びに免疫染色に適した抗体の選出等に予想以上に時間を要し予定のスピードで解析が進んでいない。以上のことから令和元年の研究進度および現在までの達成度は「やや遅れている」と考える。
Strategy for Future Research Activity	令和二年度は、遅れているin vivo評価系での検討を最優先事項として迅速に進める。具体的には以下３群のヒト肝キメラマウス：1)HBV感染無し・核酸アナログ投与無し; 2)HBV感染有り・核酸アナログ投与無し; 3)HBV感染有り・核酸アナログ投与有り,より採取された肝臓切片サンプルを用い、細胞老化関連因子の発現レベルと局在を主として免疫染色法で解析する。加えて異なるドナー由来の肝細胞を用いて上述と同様の評価を行い、これらの細胞老化に対する細胞応答が個々人によって異なるものなのか同様なのについても検討したい。これらの研究結果から、HBV感染および抗HBV核酸アナログが肝細胞老化にもたらす効果、並びに、既知および新規核酸アナログ単独の存在が肝細胞を含む多種なヒト由来細胞の老化に与える影響が一層明確になると考えられる。そのため、核酸アナログがどのようなメカニズムでHBV感染症治療時に、細胞老化を含む細胞の生理機能を修飾するのか、また核酸アナログそのものがヒト由来細胞の老化にどのようなメカニズムで影響を与えるのかについての解釈に一定の結論を出し、学術論文として発表する。