2018 Fiscal Year Research-status Report
GLUT4の空間・時間的運命を制御するインスリン・シグナルの解明
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18K08463
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
柴田 宏 群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (20235584)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | インスリン作用 / 活性酸素 / NADPHオキシダーゼ / グルコーストランスポーター / タンパク寿命 / 小胞輸送 / 脂肪細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，脂肪細胞において過酸化水素（H2O2）産生亢進をもたらすインスリン・シグナルを明らかにすることにより，GLUT4の空間・時間的運命，すなわち，GLUT4のインスリン感受性GLUT4貯蔵コンパートメント（GSC）へのターゲティングと蛋白寿命の制御機構を解明することにある。これまでの検討により，3T3-L1脂肪細胞においては，インスリン刺激時のH2O2産生源はNADPHオキシダーゼであるNox4であると考えられることから，30年度は，インスリンによるNox4活性化機構を明らかにする目的で，Nox4の細胞内局在，翻訳後修飾，分子間相互作用等を検討した。ショ糖密度勾配遠心法と蛍光顕微鏡法による検討により，インスリン刺激後Nox4は小胞体（ER）に局在したままで，細胞膜近傍へ集積した。インスリン依存性にNox4と結合する細胞膜標的分子候補として，脂肪細胞に大量に発現しているカベオリンとの結合を検討した。カベオリンはCaveolin Scaffolding Domain (CSD)（アミノ酸82-101）を介して，Caveolin-Binding Motif (CBM)をもつ種々のシグナル蛋白と結合する。Nox4のC端にはCBM配列（ΦXΦXXXXΦ）が存在し，免疫沈降法ではインスリン刺激によりNox4とカベオリンは共沈した。この結合はvanadate存在下でのみ見られることから，いずれかの蛋白のチロシンリン酸化に依存する結合と考えられた。チロシン残基に変異を導入したNox4 (Nox4-Y572F)を発現した脂肪細胞ではインスリンによるGLUT4分解促進作用が抑制されたことから，インスリンがNox4のY572チロシン残基をリン酸化すること，また同リン酸化がカベオリンとの結合に重要であることが想定された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
所属する研究室の研究テーマが，エピジェネティクス領域になり，新しい研究室の立ち上げと，エピジェネティクス領域の研究プロジェクトにもエフォートを取られるようになったため，本研究に当初予定していた60％のエフォートが割けない状況となっていることから，若干，進捗状況に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後，Nox4 (Nox4-Y572F)とカベオリン (Cav-Y14F)，およびCBM欠失変異Nox4（Nox4-ΔCBM）等の変異体を発現した脂肪細胞を用いて，両者のインスリン依存性結合に対する効果を検討する。これと平行して，東大アイソトープ総合センターの川村猛准教授に協力を依頼し，質量分析によるNox4のリン酸化部位決定にトライする。カベオリンに関してはインスリンによるリン酸化が確認されているCav-Y14F変異を用いる。結合に必要なリン酸化部位が決定した後，変異体を発現した3T3-L1脂肪細胞を用いて，インスリンによるH2O2産生に対する効果，GLUT4分解促進に及ぼす効果を検討する。H2O2 産生はH2O2 特異的蛍光プローブであるHyPer（Belousov et al. Nat Methods. 3: 281, 2006）を用いたリアルタイムモニタリング（Ma et al. 2014）により測定する。またNox4は構成性活性型であるという報告があることから，Nox4の翻訳後修飾以外の活性促進機構についても検討する予定である。これには，Nox4の基質となるNADPH産生，特に解糖系のペントースリン酸経路におけるグルコース６リン酸脱水素酵素（G6PDH）によるNADPHがインスリン作用に重要であるとの結果を得たので，G6PDHに対するインスリンの効果を検討する。
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| Causes of Carryover |
所属研究室に新任の教授が着任し，研究領域が細胞生物学からエピジェネティクス領域に変わったため，新しい研究室の立ち上げ・整備と，エピジェネティクス領域のプロジェクトにも若干のエフォートを取られたため，本研究で当初予定していたエフォートを割くことができなかったことから，初年度の計画に若干遅れが生じ，次年度への繰越が生じた。31年度は30年度に生じた研究計画の遅れを取り戻す予定である。
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