2018 Fiscal Year Research-status Report
The development of diagnostic system for thyroid follicular cancer using exosome analysis
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18K08490
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| Research Institution | Teikyo University |
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Principal Investigator |
盛田 幸司 帝京大学, 医学部, 准教授 (30535216)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伊藤 雅史 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター(東京都健康長寿医療センター研究所), 東京都健康長寿医療センター研究所, 研究部長 (80393114)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | エクソソーム / 甲状腺濾胞癌 / プロテオーム解析 / 診断マーカー / TSH受容体 / デコイ効果 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、分化型甲状腺癌の中で濾胞腺腫との鑑別が困難な濾胞癌の術前診断について、細胞から分泌されるエクソソームをターゲットに、新しい診断システムを構築することを目的としたものである。2018年度は、前提となる基礎検討、検体準備として以下を行った。
(1) 複数のヒト甲状腺癌細胞株、不死化されたヒト正常甲状腺濾胞上皮細胞（Nthy-ori 3-1）、TSH受容体を過剰発現させたHEK293細胞が、in vitroの環境下でTSH受容体を発現したエクソソームを分泌していることを確認した。さらにTSH受容体発現エクソソームが存在する環境で、TSH受容体過剰発現HEK293細胞に刺激型抗ヒトTSH受容体モノクローナル抗体（M22抗体）を添加すると、デコイ効果によりcAMP産生が低下することも確認し、機能的にも甲状腺細胞由来TSH受容体発現エクソソームの存在を立証した（Thyroid. 2019）。今後、ヒト血清中でTSH受容体発現エクソソームの検出を試みる。
(2) 倫理委員会承認に基づき、甲状腺の濾胞癌15例、濾胞腺腫51例、腺腫様結節16例、乳頭癌12例、髄様癌1例の計95例で術前後の患者血清を確保した。これらの血清（髄様癌を除く）から各疾患5検体ずつのプールサンプルを作製し、高純度エクソソームを精製した。精製後のエクソソームをトリプシン消化し、iTRAQ試薬で標識した後に、nano-LC-MS/MSによりプロテオーム解析を行い、疾患間でのエクソソームタンパクの発現パターンの違いを見い出した。今後、濾胞癌症例のエクソソームタンパクの特徴を詳細に調べ、診断に有用なマーカーの候補を同定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitroの実験ではあるが、正常甲状腺濾胞上皮細胞や甲状腺癌細胞がエクソソームを分泌していること、さらには甲状腺に特異的なマーカーとなりうるTSH受容体がエクソソームに発現していることが確認できたことは、抗TSH受容体抗体を用いて、ヒト血清で甲状腺由来エクソソームを検出できる可能性を示している。
また、患者血清から単離した高純度エクソソームのプロテオーム解析により、濾胞癌をはじめ各疾患間でのエクソソームタンパクの発現パターンに違いを見い出せたことから、今後の患者血清での疾患特異的マーカーの同定につながる結果を得られたことになる。加えて、臨床検体の確保も順調であり、有用性の検討に十分な数を揃えることができる見通しである。
このため研究は概ね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
疾患間のプロテオーム解析の結果を元に、濾胞癌の診断マーカーになる可能性の高いエクソソームタンパクを選び、それに対する抗体を入手あるいは作成する。甲状腺癌細胞とNthy-ori 3-1細胞の培養上清から超遠心法で単離したエクソソームについて、候補タンパクとエクソソームマーカーCD9・CD63等のウエスタンブロット解析を行い、候補マーカーの発現上昇を確認する。さらに、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心、CD9・CD63による免疫沈降等により分離したエクソソームのウエスタンブロット解析を行うことにより、候補マーカータンパクがエクソソームに存在することを確認する。
また、引き続き書面で同意の得られた甲状腺腫瘍患者について、術前後での血清確保を継続する（目標症例数：濾胞癌30例、濾胞腺腫100例、腺腫様結節30例、乳頭癌40例の計200例）。血清からPSアフィニティー法等により単離した高純度エクソソームのウエスタンブロット解析を行い、マーカータンパクが患者血清エクソソームに存在することを確認した後、疾患間・術前後でも解析を行い発現量を比較することで、疾患特異的マーカーとしての有用性を検証する。
マーカーとしての有用性が確認された際には、検出システムを開発し、定量的な比較解析を目指す。
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| Causes of Carryover |
研究の進展に伴い、当初予想し得なかった新たな知見、すなわち甲状腺癌細胞と不死化正常甲状腺濾胞上皮細胞がTSH受容体発現エクソソームを分泌している可能性を示唆する知見が得られ、その論文発表を優先したことから、当初の研究計画を変更する必要が生じた。
次年度使用額は、ヒト血清中でTSH受容体発現エクソソームの検出と濾胞癌の診断に有用なエクソソームマーカーの候補の同定に使用する。
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