2018 Fiscal Year Research-status Report

Role of proglucagon positive cells in pathophysiology of diabetes.

Research Project

Project/Area Number	18K08498
Research Institution	Shiga University of Medical Science
Principal Investigator	藤田征弘滋賀医科大学, 医学部, 助教 (20451461)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	プログルカゴン
Outline of Annual Research Achievements	グルカゴンとGLP-1は共通の前駆体プログルカゴンから生成される。膵臓から分泌されるグルカゴンは糖新生を亢進させ血糖を上昇させるが、消化管より分泌されるGLP-1はインスリン分泌促進やグルカゴン分泌抑制を介し逆に血糖を降下させる。最近、代謝ストレス・加齢などにより膵α細胞からGLP-1が分泌されることが報告されている。一方、消化管からもグルカゴンが分泌される可能性が示唆されているが、その詳細は明らかではない。本研究の目的は、プログルカゴン遺伝子プロモータ下に蛍光蛋白Venusを発現するmGluVenusマウスを用いて胃粘膜を含む消化管においてグルカゴン分泌細胞が存在するかを細胞レベルで再確認する。その上で、発現メカニズムや生理作用、糖尿病など代謝異常へ関わりについて転写調節の視点から明らかにする。現在、このマウスの組織で蛍光タンパクの発現について蛍光顕微鏡下で膵島（α細胞）、胃粘膜、十二指腸、空腸、回腸で確認できた。各消化管よりコラゲナーゼで消化後、フローサイトメトリー(FCM)を用いて、蛍光陽性細胞を分離した。回腸からはからはVenus陽性細胞をFCMで選択に分離するに成功したが、胃粘膜からは十分にVenus陽性細胞を採取することはできていない。今後、コラゲナーゼでの消化法を検討し、再検討する予定である。一方、粘膜中のグルカゴン含量については組織抽出液からELISA法、および受容体結合に基づくバイオアッセイ法で膵臓や小腸のみならず、胃粘膜からも抽出できている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 研究代表者が、2018年の9月に旭川医科大学から滋賀医科大学へ異動した。その異動前後実験を実施ができなかったことと、実験で使用するプログルカゴン遺伝子のプロモータ下に蛍光蛋白Venusを発現するマウス(mGluVenusマウス)について、施設間移動およびMaterial Transfer Agreement (MTA)の再申請をしなければ実験を継続できなかったため、実験の実施が遅れている。それでも、新たにオキシントモデュリンとグルカゴンの活性を測り分ける測定計は樹立した。また小腸からプログルカゴン陽性細胞を単離する方法は確立した。
Strategy for Future Research Activity	A)消化管におけるグルカゴンの存在を細胞レベルで証明する。①膵島、胃、十二指腸、空腸、回腸からVenus陽性の細胞を分取し、グルカゴンとGLP-1の細胞内含有量を ELISA法と、受容体結合cAMP産生能の基づいた測定法で測定し比較する。②グルカゴンとGLP-1発現に必須な酵素であるPC2と PC1/3の遺伝子発現について、リアルタイムPCRで測定し比較する。③膵α細胞の分化に重要な転写因子 Arx、 Maf-B、 Pax6の遺伝子発現を比較する。④胃に関しての（プロ）グルカゴン産生細胞については、陽性細胞の局在を免疫組織化学（免疫電顕をふくめ）探索する。⑤消化管ホルモンは単一細胞に複数の遺伝子が発現している事が多いことから、他の消化管ホルモンの遺伝子発現についてリアルタイムPCRで測定し、免疫組織法で確認する。 B)糖尿病状態や代謝ストレスは、消化管グルカゴンの発現を調節するか？糖尿病、肥満モデルを作成する。mGluVenusマウスに①低用量ストレプトゾトシンを投与する。②インスリン遺伝子異常糖尿病モデルであるAkitaマウスとmGluVenusマウスのホモトランスジェニックを交配する。③高脂肪食や高果糖負過食で飼育。これらで高血糖、代謝ストレスのモデルマウスを作成し、グルカゴンとGLP-1の細胞内含有量を測定し比較する。PC2と PC1/3の遺伝子発現をグルカゴンとGLP-1発現のマーカーとして用い、正常状態と、糖尿病状態とで比較する。 C)胃グルカゴンは糖尿病治療の標的になるかマウスに胃部分切除を行い、血中グルカゴン濃度をELISAと受容体結合cAMP産生能の基づいた測定法で測定する。加えて、ブドウ糖負荷、脂肪酸負荷などを行い、グルカゴンの変化と、血糖値、遊離脂肪酸、インスリン分泌との関連を明らかにする。
Causes of Carryover	研究代表者が、2018年の9月に旭川医科大学から滋賀医科大学へ異動した。その異動前後実験を実施ができなかったことと、実験で使用するプログルカゴン遺伝子のプロモータ下に蛍光蛋白Venusを発現するマウス(mGluVenusマウス)について、施設間移動およびMaterial Transfer Agreement (MTA)の再申請をしなければ実験を継続できなかったため、実験の実施が遅れている。 2019年3月に新たなMTAを締結した。　今後、遅延した研究を約10ヶ月遅れで推進する予定である。