2019 Fiscal Year Research-status Report
Role of proglucagon positive cells in pathophysiology of diabetes.
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18K08498
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
藤田 征弘 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (20451461)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | プログルカゴン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
グルカゴンとGLP-1は共通の前駆体プログルカゴンから生成される。膵臓から分泌されるグルカゴンは糖新生を亢進させ血糖を上昇させるが、消化管より分泌さ れるGLP-1はインスリン分泌促進やグルカゴン分泌抑制を介し逆に血糖を降下させる。最近、代謝ストレス・加齢などにより膵α細胞からGLP-1が分泌され、消化管からもグルカゴンが分泌される可能性も示唆されている。本研究の目的は、プログルカゴン遺伝子プロモータ下に蛍光蛋白Venusを発現するmGluVenusマウスを用いて胃粘膜を含む消化管においてグルカゴン分泌細胞が存在するかを細胞レベルで再確認する。 その上で、発現メカニズムや生理作用、糖尿病など代謝異常へ関わりについて転写調節の視点から明らかにする。
現在、このマウスの組織で蛍光タンパクの発現について蛍光顕微鏡下で膵島(α細胞)、胃粘膜、十二指腸、空腸、回腸で確認できた。STZ糖尿病マウスを作成し、小腸グルカゴン含有量の変化を観察した。前所属研究機関で各消化管よりコラゲナー ゼで消化後、フローサイトメトリー(FCM)を用いて蛍光陽性細胞を分取できていたが、現在の期間でもマウスを飼育し分取プロトコールを再検討中である。また、mGluVenusマウスから膵頭を単離し、FCMにてα細胞を分取することを開始した。
GLP-1やGIPについて受容体結合に基づく生理活性を測定するバイオアッセイを樹立しているが、グルカゴンにおいても同様の測定法を確立している。proglucagonから腸管ではGLP-1やオキシントモジュリン(OXM)が産生される。OXMとグルカゴンはC末端側のアミノ酸配列が8個異なるのみで、非常に類似したアミノ酸配列を有している)。バイオアッセイ法でOXMがグルカゴンとほぼ同等の強さでグルカゴン受容体を活性化することを確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
研究代表者が、2018年の9月に旭川医科大学から滋賀医科大学へ異動した。 その異動前後実験を実施ができなかったことと、実験で使用するプログルカゴン遺伝子のプロモータ下に蛍光蛋白Venusを発現するマウス(mGluVenusマウス)につ いて、施設間移動およびMaterial Transfer Agreement (MTA)の再申請をしなければ実験を継続できなかったため、実験の実施が遅れている。異動後、滋賀医科大学との間でMTAを新たに締結した。mGLUVenusマウスは、旭川医科大学より凍結胚を導入し、胚移植後、発現を確認し実験を再開している。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在計画より研究の進展が遅れているが、異動後研究施設でのフォローサイトメトリーなどの使用が可能になったため改めて下記の研究を推進していく。
A)消化管におけるグルカゴンの存在を細胞レベルで証明する。①膵島、胃、十二指腸、空腸、回腸からVenus陽性の細胞を分取し、グルカゴンとGLP-1の細胞内含 有量を ELISA法と、受容体結合cAMP産生能の基づいた測定法で測定し比較する。②グルカゴンとGLP-1発現に必須な酵素であるPC2と PC1/3の遺伝子発現につい て、リアルタイムPCRで測定し比較する。③膵α細胞の分化に重要な転写因子 Arx、 Maf-B、 Pax6の遺伝子発現を比較する。④胃に関しての(プロ)グルカゴン 産生細胞については、陽性細胞の局在を免疫組織化学(免疫電顕をふくめ)探索する。⑤消化管ホルモンは単一細胞に複数の遺伝子が発現している事が多いこと から、他の消化管ホルモンの遺伝子発現についてリアルタイムPCRで測定し、免疫組織法で確認する。 B)糖尿病状態や代謝ストレスは、消化管グルカゴンの発現を調節するか? 糖尿病、肥満モデルを作成する。高血糖、代謝ストレスのモデルマウスを作成し、グルカゴ ンとGLP-1の細胞内含有量を測定し比較する。PC2と PC1/3の遺伝子発現をグルカゴンとGLP-1発現のマーカーとして用い、正常状態と、糖尿病状態とで比較す る。
C)胃グルカゴンは糖尿病治療の標的になるか マウスに胃部分切除を行い、血中グルカゴン濃度をELISAと受容体結合cAMP産生能の基づいた測定法で測定する。
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| Causes of Carryover |
研究代表者が、2018年の9月に旭川医科大学から滋賀医科大学へ異動した。 その異動前後実験を実施ができなかったことと、実験で使用するプログルカゴン遺伝子のプロモータ下に蛍光蛋白Venusを発現するマウス(mGluVenusマウス)につ いて、施設間移動およびMaterial Transfer Agreement (MTA)の再申請をしなければ実験を継続できなかったため、実験の実施が遅れている。 2019年3月に新たなMTAを締結した。 前所属期間で凍結したマウス胚をもちいて、SPFでのマウスを作成しコロニーを維持している。現在、実験に使えるようなマウスの匹数を確保できるようになり、実験に用いている。ただし、研究は約半年から1年遅延している。
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