ヒトiPS細胞から膵芽細胞への分化調節分子の同定とその役割の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08510
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 豊田 太郎 京都大学, iPS細胞研究所, 講師 (60593530)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: NKX6.1 / PDX1 / 膵芽 / 膵臓 / iPS細胞 / ES細胞 / 発生

Outline of Annual Research Achievements

移植医療や創薬への応用に向けて、ヒト幹細胞（ヒトES/iPS細胞）から膵細胞を作製する研究が精力的に進められている。発生学の知見に基づき、様々な膵細胞を分化誘導することが可能となってきたが、不安定な作製効率や、目的外細胞の混入など解決すべき課題が多くある。その原因の一つとして、膵臓の基となる膵芽細胞への分化機序の全貌が不明であることが挙げられる。本研究では、膵芽細胞に特異的なマーカー遺伝子NKX6.1を指標として、ヒトiPS細胞から膵芽細胞への分化を調節する分子を網羅的に探索・同定し、その役割を解明することを目的としている。
これまでの検討から、発現を抑制することでNKX6.1+細胞への分化を阻害する分子候補を得た。そこで、候補分子が膵芽細胞への分化過程における役割を詳細に解析した。当該分子の発現抑制は、既知のNKX6.1の上流分子の発現を低下させていなかったため、新規の上流分子であると考えられた。この候補分子の発現抑制によるNKX6.1+細胞への分化阻害は、他の細胞株を用いた系や、異なる培養形態（平面接着培養、細胞塊の浮遊培養）でも確認することができた。また、分化誘導過程における遺伝子発現変化を観察したところ、膵芽への分化段階で発現が上昇していた。これらの結果は、候補分子が膵芽細胞への分化において重要な役割を担うことを支持する。
現在、候補分子が分化誘導を惹起する分子であるか検証を試みている。このため、当該分子の解析に有用な遺伝子改変をした細胞株を新たに樹立する準備を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究の目的である、膵芽細胞（NKX6.1+）への分化機序解明に関して、新規経路を同定するためのsiRNAスクリーニング系から得られた候補の精査を実施しており、それによって候補分子の関与を支持する知見をいくつか得た。また、当該分子の解析に有用な遺伝子改変する方法の準備を進めている。これらによって分化機序の解明が進展すると考えられるため、目標達成に向けて順調であると考える。

Strategy for Future Research Activity

分化過程における候補分子の役割を検証するため、分化誘導の途中で遺伝子導入により標的分子のシグナルを直接活性化（野生型あるいは活性型の発過剰現）する。あるいは、任意のタイミングで目的遺伝子の発現量を調節できるヒトiPS細胞株を樹立し、この細胞株から膵系譜細胞を分化誘導する。そして、候補分子の活性化が膵芽細胞への分化を促進するか検討する。細胞株樹立には、遺伝子が正確に導入され、遺伝子導入後も分化誘導効率が正常かつ、標的分子候補の活性調節可能な細胞株を選別する。候補分子の活性調節によってNKX6.1+細胞が誘導される場合は、誘導された細胞が膵芽細胞であることをin vitroやin vivoにて検証する。
また、候補分子のシグナル活性が、膵前駆細胞（PDX1+）の段階で、膵芽細胞（NKX6.1+）への分化指向性を予測する指標となりうるかを検討する。膵前駆細胞（PDX1+）から膵芽細胞（NKX6.1+）への分化過程にて、候補シグナルの活性と分化効率をフローサイトメトリーにて測定し相関性を検討する。これにより、候補分子が膵前駆細胞の亜集団を分類する新規指標であるかを検証する。