2018 Fiscal Year Research-status Report
MIRAGE症候群: ゲノム編集による疾患モデルマウスの作成と病態解明
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18K08527
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
長谷川 奉延 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (20189533)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高田 修治 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, システム発生・再生医学研究部, 部長 (20382856)
鳴海 覚志 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 分子内分泌研究部, 室長 (40365317)
石井 智弘 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 准教授 (70265867)
天野 直子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (70348689)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | MIRAGE症候群 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々が疾患概念を確立したMIRAGE症候群（以下本症候群）は、造血異常、易感染性、成長障害、先天性副腎低形成症、性腺症状、消化器症状を主症状とし、責任遺伝子はSAMD9である（Nat Genet 2016, 48: 792-797、http://omim.org/entry/617053）。
本研究の目的は本症候群の病態をin vivoで解明することである。本年度は、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により、本症候群で認めたSAMD9点変異をマウスに導入し、本症候群モデルマウスを作成した。すなわち、まず先行研究で作成したROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3’側にred fluorescent protein (RFP)-野生型SAMD9をヘテロ接合性に有するROSA26/Sノックインマウス同志を掛け合わせ、ROSA26遺伝子プロモーターの制御下でloxP-終止コドン-loxPの3’側にRFP-野生型SAMD9をホモ接合性に有するマウスを作成した。このホモ接合性マウスとCAGプロモーター制御下でタモキシフェン誘導型Creリコンビナーゼを発現するCAG/Cre-ERT2トランスジェニックマウスを交配し、タモキシフェン投与下にヒト野生型SAMD9を発現するマウス（以下対照マウス）を得た。対照マウスの精巣上体から精子を採取し、この精子と野生型マウスの卵子を体外受精させた。得られた受精卵にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入した。結果としてタモキシフェン投与下にp.R1293Wを発現する本症候群モデルマウスの作成に成功した。さらに対照マウス、本症候群モデルマウスともに出生可能であること、および出生後タモキシフェン非投与下において生存可能であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り、研究代表者（長谷川奉延）が本年度のすべての研究を総括し、研究分担者である石井智弘、鳴海覚志、天野直子の3名が対照マウスと疾患モデルマウスの作成を担当した。
本年度もっとも困難が予想された研究過程は、対照マウスの精子と野生型マウスの卵子との体外受精による受精卵にCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入するプロセスであった。第1に確実にSAMD9点変異(p.R1293W)を導入すること、および第2に標的とする配列以外のゲノム領域に意図しない突然変異が導入（オフターゲット効果）されないこと、の2点ともに満たすことが必要であった。この2点を確実に満たすために、マウス受精卵のゲノム編集技術に豊富な経験を有する研究分担者高田修治の指導を受けた。複数回のゲノム編集を行い、その都度、PCR-直接シークエンス法によりSAMD9点変異(p.R1293W)導入の成功の可否を確認した。目的の点変異導入を確認したマウスにおいて全エクソームシークエンスにより標的とする配列以外のゲノム領域に意図しない突然変異が導入されていないことも確認した。結果としてタモキシフェン投与下にp.R1293Wを発現する本症候群モデルマウスの作成に成功した。
現在対照マウスおよび疾患モデルマウスをタモキシフェン非投与下において飼育中である。現時点までに対照マウス、本症候群モデルマウスともに出生可能であること（胎子致死ではないこと）、および出生後タモキシフェン非投与下において通常の飼育条件で生存可能であることを確認し、さらに飼育継続中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
すでに、対照マウスと本症候群モデルマウスの飼育を継続している。それぞれのマウスにおいて、出生時・2週齢・4週齢・8週齢・24週齢における体長および体重の計測、さらに本症候群における主要罹患臓器である胸腺、副腎、性腺、腸管の光学および電子顕微鏡学的評価、免疫組織学的評価を行う。副腎機能については血中ACTHおよびコルチコステロンの測定も行う。
Preliminary dataではあるが、4週齢の本症候群モデルマウスの体調・体重は対象マウスより小さいかもしれない。このことは、タモキシフェン非投与下でも本症候群モデルマウスの各種臓器にSAMD9点変異(p.R1293W)がleaky expressionしている可能性を示唆する。現在、4週齢の本症候群モデルマウスを屠殺し、胸腺、副腎、性腺、腸管を含む全身各臓器からmRNAを抽出し、SAMD9点変異(p.R1293W)のleaky expressionの有無を確認中である。
さらに、本症候群モデルマウスの胎児期（妊娠母体）、生下時あるいは離乳後にタモキシフェンを投与した後、上述と同様の評価をおこなう。本症候群の中核症状の1つである副腎低形成の病態を解明するため、副腎の経時的な網羅的遺伝子発現解析も予定している。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額（B-A）が「0」より大きい理由は以下の通りである。高田修治の指導のおかげでCRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術により本症候群で認めたSAMD9点変異(p.R1293W)を導入するプロセスが予定より安価に済んだ。
翌年度分として請求した助成金とあわせ、当初の予定よりもより多く、かつより詳細に対照マウスと本症候群モデルマウスの光学および電子顕微鏡学的評価、免疫組織学的評価を行う予定である。
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[Journal Article] MIRAGE syndrome is a rare cause of 46,XY DSD born SGA without adrenal insufficiency.2018
Author(s)
Shima H, Hayashi M, Tachibana T, Oshiro M, Amano N, Ishii T, Haruna H, Igarashi M, Kon M, Fukuzawa R, Tanaka Y, Fukami M, Hasegawa T, Narumi S.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 7;13(11)
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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