Metabolic significance of lysosomal beta-alanine

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08528
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 上野 隆 順天堂大学, 大学院医学研究科, 客員教授 (10053373)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 數野 彩子 順天堂大学, 大学院医学研究科, 助教 (00338344)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: リソソーム / β－アラニン / 5,6－ジヒドロウラシル / ウレイドプロピオン酸 / ウラシル / ウレイドプロピオナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

ラットやマウスの肝臓のオートリソソームやリソソームにタンパク質に含まれないアミノ酸であるβ－アラニンが多量に存在する。β－アラニンは、RNA分解で生成したピリミジン塩基のウラシルがジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（DPYD）反応で5,6－ジヒドロウラシルを経て3－ウレイドプロピオン酸（UPA）となり、ウレイドプロピオナーゼ（UPB1）の働きで作られる。そこで、ウラシル分解で生成されたサイトゾルのβ－アラニンが（オート）リソソームに輸送されて内腔に貯留すると考え、これを検証しようと試みてきた。これまで合成系の2つの酵素（DPYDとUPB1）の触媒活性が非常に弱い弱いことが判明したので、細胞内β－アラニン生成反応の証明は取り敢えず脇に置き、21年度はβ－アラニンがリソソームへ取り込まれる輸送システムが機能するかを調べることにした。14C－β－アラニンを用いて培養細胞系に加えてインキュベートすると時間に比例して細胞内への14C－β－アラニン取り込みが直線的に1時間程度増え続けることが解った。この取り込みは培地にグリシンやα－アラニンを加えておくと抑制されるので、グリシンやα－アラニンと共通の輸送体によってβ－アラニンが細胞内へ取り込まれることを示唆している。ラットやマウスの餌には一定量のβ－アラニンが含まれているので、食餌から摂取したβ－アラニンが肝臓や他の末梢組織で取り込まれ、リソソームに輸送される可能性も考慮する必要が有る。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

技術的困難に直面している。現在培養細胞から（オート）リソソームを分離し、in vitroでのβ－アラニン輸送活性を直接測定することを試みている。単離したリソソームを、Mg-ATP存在下に14C－β－アラニンをインキュベートしてメンブレンフィルターへのトラップ実験で証明しようと試みている。純度の高いリソソームを分離するために、予めデキストランを培地に加えてデキストランがエンドサイトーシスでリソソームに到達後、密度が高くなって他の膜成分と分離されやすくなったものを密度勾配遠心で分画する条件検討を行っている。ATP依存に14C－β－アラニンがリソソームに輸送されることが証明できれば、少なくともリソソームがβ－アラニンを貯留していることは結論付けられよう。　　輸送系の生理的意義としてラットやマウスの食餌に相当量のβ－アラニンが含まれることが在る。食餌から供給されるβ－アラニンが肝細胞に取り込まれリソソームへ到達する道筋が存在することを示唆している。
サイトゾルのウラシル分解系でβ－アラニンが生成する活性が非常に弱いことに関して、そもそもβ－アラニンがリソソームの中で作られる可能性が無いだろうかと視点を変えてみた。ウラシルからβ－アラニンを生成する2つの酵素系（DPYD, UPB1）は選択的にオートファゴソームに取り込まれる基質特有のLIRモチーフを持つことに注目した。実際、ウエスタンブロットでラットやマウスの肝臓から分離したオートリソソームに2つの酵素が取り込まれていることを確認した。そこで、酵素系がオートファジーでオートファゴソームに取り込まれ、同じようにオートファゴソームに取り込まれたリボソームのRNAが加水分解され、リソソームの酸性5’－ヌクレオチダーゼや5’－ヌクレオシダーゼの働きで生成したウラシルを基質としてβ－アラニンが作られる可能性を探ることは面白いアプローチとなる。

Strategy for Future Research Activity

まず、リソソームへのβ－アラニン輸送活性を証明することに専念する。肝細胞系の培養細胞（BRL, RLC27, HepG2）やマウス肝臓から密度勾配遠心によって単離した（オート）リソソームを用いてin vitroでの取り込みを測定することをさらに推し進める。Mg-ATPが無条件に必要であることは確かであろう。一番の困難は単離したリソソーム膜の脆弱性が無視できないことである。リソソーム内腔に取り込まれても漏出してしまっては正確な取り込み量を求めることは至難となる。リソソーム膜を補強すると認められている薬剤を使うことも必要かもしれない。哺乳動物リソソームや酵母の液胞へのアミノ酸取り込みはプロトンポンプの働きが前提となるので、β－アラニンの輸送もバフィロマイシンやナイジェリシンに感受性となるはずである。
β－アラニン輸送系の証明に加えて重要となるのは、リソソームでのウラシル分解系の働きで5,6－ジヒドロウラシルとUPAを経てβ－アラニンが生成するという仮説の証明である。このメカニズムの利点は、出発物質のウラシルをオートリソソーム内腔でリボソームRNAから作り出すことが出来ることにある。ウラシルがオートリソソームで作られさえすれば、あとは選択的オートファジー基質となるDPYDとUPB1がリソソーム内腔で酵素活性を（リソソームで分解される前の）どのくらいの時間発揮できるかによってβ－アラニン生成量が決まることになる。この実験の可否を握るもう一つの要素はUPAやβ－アラニンを高感度で定量する方法である。この目的のために当該研究機関に設置されているcapillary-electrophoresis mass spectrometer (CE-MS)による検出・定量を行うこととする。

Causes of Carryover

リソソーム分離に必要不可欠な超遠心機が故障し、部品の調達（半導体関連）がコロナパンデミックで著しく遅れ、結局21年度に間に合わず、研究機関の別予算で新しい超遠心機を購入したのが12月であった。これにより2度目の延長手続きを行った。22年度は研究課題遂行に必須な実験、具体的には培養細胞やマウス肝臓からパーコールやOptiPrepによる密度勾配遠心を行って、（オート）リソソームを精製し、in vitroでの14C-β－アラニン輸送活性測定を行い、当初の研究目的を果たすことに努める。