2018 Fiscal Year Research-status Report
Identification of the antigen molecule that is recognized by a human brown adipocyte-specific monoclonal antibody
| Project/Area Number |
18K08533
|
|---|
| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
|---|
Principal Investigator |
佐伯 久美子 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, その他 (80322717)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ヒト褐色脂肪細胞 / ヒト胚性幹細胞 / モノクローナル抗体 / 肥満 / 糖尿病 / 血清診断マーカー / 高感度検出系 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
褐色脂肪細胞(brown adipocyte: BA)は加齢・肥満・糖尿病で減少する熱産生脂肪で、世界的に増加している肥満や２型糖尿病等の代謝異常の病態把握のための重要な位置づけにある。BAの代謝改善作用は熱産生とは独立に可溶性因子を介してもなされるが詳細は不明である。また別種の熱産生脂肪であるベージュ細胞と区別してヒト生体のBAを認識する手段もない。本研究では、代謝異常の１亜型である「褐色脂肪不全」の診断開発に向け、ヒト生体のBA量を反映する血清マーカーを得るべく、申請者が作製した「ヒト胚性幹細胞由来BA特異的モノクローナル抗体」が認識する血清抗原を同定する。具体的には、ヒト胚性幹細胞由来BA溶解液を材料として、抗体反応性を確認しながら液体高速クトマトグラフィー(HPLC)で目的分子が存在する画分の精製作業を繰り返して行い、最終精製分画をSDS-PAGEで分離した後、クマシー染色により可視化された蛋白バンドを切り出し、質量分析装での解析からアミノ酸構造を決定する。これにより、ヒト生体BA量の反映する血清マーカーが同定される。
本年度の研究では、ヒト胚性幹細胞由来BA溶解液を限外濾過により濃縮後、４種類のカラム（陽イオン交換カラム、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラム、疎水カラム）を用いたHPLCにより十分量の目的分子を精製し、SDS-PAGE泳動後に目的バンドを切り出して質量分析を行なった。しかし目的蛋白がクマシー染色剤を介してゲルに極めて強度に結合し、汎用法ではゲルから溶出されないことが判明した。抗原分子がこのような「特異な性質」を示す理由は不明であるが、現在、上記工程を繰り返して当該分子を再精製中であり、精製後はSDS-PAGEを行わずに最終精製分画を凍結乾燥して質量分析を行う計画である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、代表者が「生きたヒト胚性幹細胞由来BA」を免疫原として得たモノクローナル抗体が認識する抗原分子が血清中に存在することを見出したことに基づき、当該分子をBA不全の診断マーカーとして活用すべく、ヒト胚性幹細胞由来BA溶解液を材料として抗原分子を同定し、その高感度検出系を構築することを３年の研究期間で実行する。初年度では、HPLCを用いてヒト胚性幹細胞由来BA溶解液から抗原分子を純化し、質量分析によりアミノ酸構造を同定するまでを計画していた。すでに、HPLCによる精製方法を確立し、目的分子の純化に成功し、質量分析装置での解析までの工程を終了したことから、概ね順調に進展していると判断した。ただし、目的分子が通常では考えられない特異な性質を持つこと、即ち、クマシー染色後にSDS-PAGE上で可視化された目的バンドが汎用法ではゲルから溶出されないという予想外の事実に遭遇したため、現在、目的分子の純化作業を再試行中である。代表者が知るかぎり「クマシー染色剤を介してゲルに不可逆的に結合する」という特異な性質を持つ蛋白は例がなく、当該分子は極めてユニークな修飾を受けた蛋白であると考えられる。現在、この問題を解決すべく、HPLC精製後はSDS-PAGEを行わずそのまま凍結乾燥して質量分析を行うことを計画している。すでに、ヒト胚性幹細胞由来BA溶解液からの目的分子の大量精製を開始しており、３週間以内に精製を完了して質量分析が実行される見込みである。
|
| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究により、抗原分子は、クマシー染色剤を介してSDS-PAGEゲルに不可逆的に結合する、という特異な性質を持つことが明らかとなった。このような特異性質をもたらす分子基盤は現時点では明らかではないが、何らかのユニークな修飾を受けた蛋白であることが推測され、実際、これまで世界中でヒトBAの血清マーカーの探索が進められながら同定されなかった理由の一端であるとも想定される。このような問題は、最終精製ステップにおけるSDS-PAGEでの分離工程を省くことで解決され、かつ、高い技術と豊富な経験を持つ実施者に質量分析作業を委託することで（すでに委託契約済み）、当該工程を省いても質量分析にて目的分子のアミノ酸構造は同定できる。現在、目的分子の大量精製作業をやり直しており、質量分析により１ヶ月以内にアミノ酸配列の候補が得られる見込みである。得られた候補については、順次、大腸菌またはヒトHEK293細胞株にその発現ベクターを導入し、ヒト胚性幹細胞由来BA特異的モノクローナル抗体との反応性が確認されたものを目的分子として同定する。
目的分子のアミノ酸構造が同定された後は、当該分子を特異的に認識するモノクローナル抗体を新規に複数種を作製し、血清中に存在する抗原分子を高感度に検出するためのシステム（サンドイッチELISAなど）を構築する。
|
Research Products
(4 results)
-
-
[Journal Article] Fasting-dependent Vascular Permeability Enhancement in Brown Adipose Tissues Evidenced by Using Carbon Nanotubes as Fluorescent Probes.2018
Author(s)
Yudasaka M, Yomogida Y, Zhang M, Tanaka T, Nakahara M, Kobayashi N, Okamatsu-Ogura Y, Machida K, Ishihara K, Saeki K, Kataura H.
-
Journal Title
Scientific Reports
Volume: 27
Pages: 14446
DOI
Peer Reviewed / Open Access
-
-
