2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification of the antigen molecule that is recognized by a human brown adipocyte-specific monoclonal antibody
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18K08533
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
佐伯 久美子 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, その他 (80322717)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒト褐色脂肪細胞 / ヒト胚性幹細胞 / モノクローナル抗体 / 肥満 / 糖尿病 / 血清診断マーカー / 高感度検出系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
褐色脂肪細胞(BA)は加齢・肥満・糖尿病で減少する熱産生脂肪で、世界的に増加している肥満や２型糖尿病等の代謝異常の病態把握のための重要な位置づけにある。BAは熱産生能とは独立に可溶性因子を介して代謝を改善するが詳細は不明である。また別種の熱産生脂肪であるベージュ細胞と区別してヒト生体のBAを認識する手段もない。本研究では「ヒト生体のBA量を反映する血清マーカー」を得るべく、申請者が作製した「ヒト胚性幹細胞由来BA特異的モノクローナル抗体（IgM)」が認識する血清抗原を同定する。具体的には、ヒト胚性幹細胞由来BA溶解液（BA液）を材料として液体高速クトマトグラフィー(HPLC)で目的分子を精製、最終精製分画をSDS-PAGEで分離した後、クマシー染色で可視化された蛋白バンドを切り出し、質量分析装での解析からアミノ酸構造を決定する。これにより「ヒト生体BA量の反映する血清マーカー」が同定される。
昨年度までの研究では、ヒト胚性幹細胞由来BA溶解液を限外濾過で濃縮後、４種類のカラムを用いたHPLCで精製しSDS-PAGE泳動後に目的バンドを切り出して質量分析を行なったが、目的蛋白がクマシー染色剤によりゲルに強固に結合し、汎用法ではゲルから溶出されず質量分析ではペプチドピークが全く検出されなかった。本年度は当該蛋白の生化学的解析を深めた結果、当該タンパクが極めて高い脂溶性を示すためにアセトン抽出分画に回収されることを見出し、BA液をアセトン抽出後にHPLCで精製後、凍結乾燥して質量分析を行った。しかし、雑多なピークが検出され、個々のピークに可能性を検証したが当該分子のアミン酸配列の同定に至らなかった。そこで来年度は戦略を変え、IgG化モノクローナル抗体を用いてBA液を免疫沈降、及び、HPLC精製後に質量分析を行う計画とした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究が同定に取り組む「BA特異的分泌性蛋白」は、多く研究者が長年取り組んできたにも関わらず未同定である「BA血清マーカー」の同定に挑むものであり、その「特異な化学的性質」から、一般的な方法では同定はできないことを当初より想定している。本年度までに実施した質量分析ではネガティブな結果しか得られていないが、精製過程で目的分子の性質に関する様々な情報を得ることができている（クマシー染色剤と反応してSDS-PAGEゲルから溶出不能になること、疎水カラムでは90%アセトニトリル液で溶出されること、蛋白でありながらアセトンで抽出されること、等）。これらの情報を得たことは前進であり、それをもとに試行錯誤して目的蛋白が純化されることを当初より計画している。すなわち、来年度までの３年間で目的蛋白の同定を目指しており、これまでの結果から、汎用の蛋白精製技術は当該分子の精製には有効でなく、「IgM型モノクローナル抗体のIgG化と、それを用いた免疫沈降」が精製に必須であると言う結論を出すことができている。最終年度はこの方法で目的蛋白の同定に挑む計画であり、研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト褐色脂肪細胞特異的モノクローナル抗体はIgMであるが、IgM抗体は免疫沈降ができないため、免疫沈降を使って抗原分子の精製を行う場合は、IgM抗体のIgG化が必須の工程となる。但し、モノクローナル抗体を作製した際にIgG抗体が取得されずIgM抗体のみが取得されたクローンであること、極めて脂溶性の高い分子であることから、当該抗体をIgG化した際にはaffinityもspeciicityも低下するためavidityが大きく低下することも予想される。今後は、「ヒトES細胞由来BA溶解液からIgG化抗体を用いた免疫沈降サンプル」を用いて、これまでと同様にHPLCで精製作業を進めた上で、SDS-PAGEでの分離作業を行わずに、質量分析機での解析を行い、分子構造（アミノ酸一次配列、並びに、脂質付加修飾等）を決定する。
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Research Products
(1 results)
