2018 Fiscal Year Research-status Report
Role of Autophagy in the Cellular Immunity of Biliary Atresia
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18K08535
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
齋藤 武 千葉大学, 大学院医学研究院, 准教授 (20406044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
幡野 雅彦 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (20208523)
吉田 英生 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (60210712) [Withdrawn]
坂本 明美 千葉大学, バイオメディカル研究センター, 准教授 (90359597)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 制御性T細胞 / 細胞性免疫 / オートファジー / ウェスタンブロッティング / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2018年度は、健常児3名(各2, 5, 8歳)の血液サンプル2-3mlを用い、各T細胞分画のsortingをflowcytometryと免疫磁気ビーズで試みた。CD3, CD4, CD8分画は識別可能であり、各10.3±4.6％, 7.5±3.3％, 3.4±2.4％であった。現在CD4, CD8分画を、CD45とCD62Lを用いてナイーブ細胞、central memory subset、effector memory subsetに分別することを試みているが、収集効率が不安定である。成人血液検体を用いることで、実験系の確立を目指す。
並行して、成人CD3, CD4, CD8分画のオートファジー機能を検証している。各分画細胞抽出液を用い、ウェスタンブロティング法にてLC3-Ⅱ(lipidated form of microtubule-associated protein 1 light chain 3)とp62発現量を調べた。再現性を確かめ、BAを含む小児例で同実験を試みる。
一方、BAのTreg機能検証実験を継続しており、今年度はTreg specific demethylation region (TSDR)と免疫染色実験の系を確立した。前者ではメチル・非メチル化特異的probeと、両者の共通のプライマーを設計した。TSDRを含む人工遺伝子を作成し、脱メチル化率0％と100%のサンプルを得、希釈列よりqPCRのstandard curveを作成した。後者では、CD4とFoxp3の蛍光染色の条件を検討した。Positive controlとして先天性胆道拡張症と肝芽腫のパラフィンサンプルを用い、染色条件を検討し、胆管周囲と腫瘍内のCD4+Foxp3+細胞(Treg)を検出した。両実験とも、今後BA検体を用いて、本実験を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2018年度は血液サンプルを用い、各T細胞分画のsortingを試みた。CD3, CD4, CD8分画は識別可能で分離抽出できたが、後者二つをナイーブ細胞、central memory subset、effector memory subsetに選別する過程で進捗が遅れている。理由は、選別に有用とされる表面マーカーCD45とCD62Lが結合する細胞数が絶対的に少ないことに由来すると想定される。大本の血液量を増やしつつ、実験系を見直し、精度を改善している最中である。成人では血液5mlから、ナイーブ細胞、central memory細胞、effector memory細胞が安定して採取できており、今年度は対象を小児に移行する。
ウェスタンブロティング法についても、現時点では成人健常者検体を用いている。autophagyの指標として頻用されるLC3-Ⅱとp62の発現はほぼ一定して確認できており、実験系はおおむね確立できたと判断している。今後これを小児健常者に適用し、定常状態における小児例のそれを検証する。
また、TSDR実験開始当初は、既報の条件を用いてもqPCRが機能せず、諸条件の検討を要したため、進捗はやや遅れている。免疫組織染色では、肝臓の実質組織の自家蛍光が強く、低減法に難渋したが、現在CD4, Foxp3の二重蛍光免疫染色の実験系は確立できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度は、小児のBA/non-BA患児で、T細胞全般(CD3)とhelper/細胞障害性/制御性/ナイーブ/メモリーT細胞分画を選別・抽出する。その多寡を検討した後、各分画のオートファジー活性を検証する。活性を変動させるファクターとして、anti-CD3-CD28を投与したり1%FBS下で培養したり(飢餓状態と解釈されるオートファジー誘発因子)する。これら外的要因に対するオートファジー活性の変化率を、両群で比較する。本実験でも実験系が安定するまで試行錯誤することが予想され、適宜、成人血液を用い実験系の妥当性を評価する必要がある。
また電子顕微鏡でも当該細胞のオートファジー能を評価する。一般に細胞内のautophagic vacuoles の大きさ・数・分布は活性を示すとされる。よって各T細胞50細胞当たりのvacuoles を数え、平均size を計測し、さらに3個以上のvacuoles を有する細胞数を算出する。これも外的因子で刺激し活性の変化率をもとめ、BA群とnon-BA群で比較する。
TSDR実験では、脱メチル化率を細かく設定した希釈系列と、健常人CD4+T細胞より抽出したDNAを用い、至適qPCR条件を追求する。今後、蓄積した患者検体でCD4+T細胞中のTregの多寡をqPCRで測定する。新規患者のサンプル収集を継続しつつ、肝検体に本法を応用する。結果、局所の機能性Tregを定量することが可能となり多角的評価が可能となる。免疫組織染色では、患者検体を用いて本実験を行う。Tregの機能分子であるTGF-β, IL-10, CTLA-4を共染色し、BAとnon-BAを比較することで、BAの病因・病態形成における局所Tregの意義を検証する。
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| Causes of Carryover |
本年度実験試薬類を購入する際に生じた端数である。次年度使用するの備品類の購入に充てる予定である。
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[Journal Article] Soluble factors derived from neuroblastoma cell lines suppress dendritic cell differentiation and activation.2019
Author(s)
Harada K, Ihara F, Takami M, Kamata T, Mise N, Yoshizawa H, Hishiki T, Saito T, Terui K, Nakata M, Komatsu S, Ikeuchi T, Nakayama T, Yoshida H, Motohashi S.
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Journal Title
Cancer Sci.
Volume: 110
Pages: 888-902.
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Frequency and proliferative response of circulating invariant natural killer T cells in pediatric patients with malignant solid tumors.2018
Author(s)
Hishiki T, Mise N, Harada K, Ihara F, Takami M, Saito T, Terui K, Nakata M, Komatsu S, Yoshida H, Motohashi S.
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Journal Title
Pediatr Surg Int.
Volume: 34
Pages: 169-176
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Invariant natural killer T infiltration in neuroblastoma with favorable outcome.2018
Author(s)
Hishiki T, Mise N, Harada K, Ihara F, Takami M, Saito T, Terui K, Nakata M, Komatsu S, Yoshida H, Motohashi S.
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Journal Title
Pediatr Surg Int.
Volume: 34
Pages: 195-201
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Analysis of the frequency and function of regulatory T-cell using human blood samples in biliary atresia.2019
Author(s)
Oita S, Saito T, Sakamoto A, Terui K, Nakata M, Komatsu S, Harada K, Shinno Y, Fujimura L, Hatano M, Yoshida H.
Organizer
52nd Annual Meeting of the Pacific Association of Pediatric Surgeons
Int'l Joint Research
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[Presentation] 胆道閉鎖症の病態形成における制御性T細胞の意義2018
Author(s)
笈田 諭, 齋藤 武, 坂本明美, 照井慶太, 中田光政, 小松秀吾, 原田和 明, 秦 佳孝, 勝海大輔, 古金遼也, 藤村理紗, 幡野雅彦, 吉田英生．
Organizer
第45回日本胆道閉鎖症研究会
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