2020 Fiscal Year Research-status Report
Role of Autophagy in the Cellular Immunity of Biliary Atresia
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18K08535
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| Research Institution | Chiba Cancer Center (Research Institute) |
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Principal Investigator |
齋藤 武 千葉県がんセンター(研究所), がん治療開発グループ がん遺伝創薬研究室, 主任医長 (20406044)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
幡野 雅彦 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (20208523)
吉田 英生 千葉大学, 大学院医学研究院, 教授 (60210712) [Withdrawn]
坂本 明美 千葉大学, バイオメディカル研究センター, 准教授 (90359597)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | オートファジー / 制御性T細胞 / 細胞性免疫 / ウェスタンブロティング / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2020年度は、末血T細胞におけるautophagic vacuolesの特徴につき、胆道閉鎖症(Biliary Atresia: BA)と疾患コントロールで電子顕微鏡下に比較した。Autophagosome の定義は以下のうち少なくとも2 点を満たすものとした-①二重膜、②vacuole の細胞質側にribosomeを有さない、③vacuole の内腔側のdensityが細胞質側と類似する、④液胞内に細胞内小器官が完全にもしくは遺残して存在する。一方autolysosome は一重膜で内部に不定形物質を含むものとした。Autophagosome とautolysosome の両者をカウントし、autophagic vacuolesとして算出した。末血T細胞50 個当たりのvacuoles数は対照群 8.5±3.6, BA 17.3±7.5でありBAで有意に多かった。3個以上のautophagic componentsを有するT細胞数は、対照群0.5±0.7, BA 3.3±2.5であり、BA T細胞のautophagy機能が亢進していた。
末血Tリンパ球におけるLC3-II発現をウエスタンブロティングで検索すると、BAは対照群より高発現する傾向がみられた。T細胞subsetの検討では、BAのCD4/CD8 memory細胞ではnaive細胞よりともに4倍ほど高発現していた。
また肝組織の免疫組織染色を試み、p62とLC3-Ⅱ分画の局在と発現を調べた。BAでは対照群に比し、p62が肝内微小胆管で有意に高発現し、それは胆管上皮細胞核内に認められた。p62とLC3-Ⅱは胆管上皮細胞で共発現していたが、後者は細胞質内で蓄積しており、BAではautophagy機能、とくにautophagosomeとautophagolysosomeの形成の過程異常を有している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者の異動により実験環境が変わったため、新たな環境への適応に時間と手間を要し研究進捗が遅れた。しかし研究分担者の尽力により、BAと対照群の末血Treg(CD4+CD25+CD127-)細胞の平時(spontaneous)/誘導時(induced)のautophagy機能につき知見を得た。平時においてTregにおけるLC3-IIとp62のタンパク発現レベルは、BAと対照群で有意差を認めなかったが、anti-CD3-CD28によるT細胞刺激下ではBAの両タンパクの発現レベルは有意に上昇した。
high-mobility group box-1 (HMGB1)はdamage-associated molecular pattern molecules (DAMPs)であり、免疫系を賦活化しauthophagyを誘導する。TregにおけるHGMB1の発現をmRNA/タンパクレベルで調べると、BAは対照群に比し3-4倍ほど高発現していた。本結果は、BAのTreg細胞においてDAMPsがそのautophagy機能を活性化していることを示唆させる。現在、患児より相当量のTreg細胞を純化抽出し、電子顕微鏡下にautophagic vacuolesを観察することを試みている。肝胆道組織を用いた実験では、BAの肝内胆管上皮細胞におけるautophagy機能の亢進が明らかであり、これが病態形成の一面を示唆しているのかもしれない。
末血Treg細胞でみられたautophagy機能の特徴が他のT細胞群にも該当するのか、検討項目であり、現在CD3, CD4, CD8分画に探索の範囲を広げている。さらに後者2種類はCD45RAとCD62Lの標識によりnaive, central, effectorが判別できるため、同様に検索を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの実験より、BAの肝内胆管上皮細胞と末血Treg(刺激時)におけるautophagy機能の亢進が推察される。またそれを惹起するhigh-mobility group box-1 (HMGB1)が両者で高発現していることが示された。
一方、標的細胞のLC3-IIが高発現する機序として、上流のautophaosome形成が促進される場合と、下流のautophagosomelysosome fusionが阻害される場合が考えられる。今後、両者を見極める目的でE64dとpepstatin A存在下で同様の実験を施行する。E64dとpepstatin Aは、LC3-II/autophagosome分解を阻害するためLC3-II高発現の機序が理解できる。
加えてBAのTregで観察されたautophagy活性が、他のT細胞subsetでも一律に認められるのか検討する必要がある。さらにproautophagic刺激である低FBS培地において、各T細胞subsetのautophagy活性がどのような振る舞いを示すか、明らかにする。
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| Causes of Carryover |
2020年度は研究代表者が所属施設を異動し、新たな実験体制を構築することに時間を要したため、支出が生じなかった。加えてコロナ感染の猛威により、研究実施場所が一時期閉鎖され、所属施設の研究活動が一時一律に停止した。研究分担者は前年度に購入した試薬や物品類の残りを使用しながら、実験を継続していた。
2021年度はこれまでの実験結果の再現性を確認するとともに、BAのT細胞subset分画におけるautophagy機能を探索する必要があり、相応の支出が見込まれる。また本研究課題の最終年度にあたり、関連学会や研究会への参加と発表、英文・和文論文の執筆などに研究費を使用する。
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[Journal Article] Optimization of surgical timing of congenital diaphragmatic hernia using the quantified flow patterns of patent ductus arteriosus.2021
Author(s)
Shinno Y, Terui K, Endo M, Saito T, Nakata M, Komatsu S, Oita S, Katsumata Y, Saeda Y, Ozeki G, Ohsone Y, Hishiki T.
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Journal Title
Pediatr Surg Int.
Volume: 37
Pages: 197-203.
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Phenotypic characteristics of pediatric inflammatory bowel disease in Japan: results from a multicenter registry.2020
Author(s)
Arai K, Kunisaki R, Kakuta F, Hagiwara SI, Murakoshi T, Yanagi T, Shimizu T, Kato S, Ishige T, Aomatsu T, Inoue M, Saito T, Iwama I, Kawashima H, Kumagai H, Tajiri H, Iwata N, Mochizuki T, Noguchi A, Kashiwabara T, Shimizu H, Suzuki Y, Hirano Y, Fujiwara T.
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Journal Title
Intest Res.
Volume: 18
Pages: 412-420.
DOI
Peer Reviewed
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