可視化モデルによるセロトニン神経の機能解析と小児腸管蠕動不全症への挑戦

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08554
• Research Institution: Osaka Medical College
• Principal Investigator: 富山 英紀 大阪医科大学, 医学部, 講師 (20298433)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷口 高平 大阪医科大学, 医学部, 講師 (70779686) ; 内山 和久 大阪医科大学, 医学部, 教授 (80232867)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 腸管神経系 / 蠕動 / ゼブラフィッシュ / セロトニン

Outline of Annual Research Achievements

透明のまま発生・分化し、消化管運動の観察が可能なゼブラフィッシュを用いて、腸管神経系におけるセロトニン神経の機能と腸管蠕動不全症の病態の解明を行っている。GAL4エンハンサートラップ法により作成されたゼブラフィッシュモデルgSAIGFF249Aを用いた免疫組織化学染色により、心臓のペースメーカーチャネルに発現しているHCN4遺伝子が、腸管神経系においてセロトニン神経で特異的に発現していることを確認した。またトリプルトランスジェニックモデルgSAIGFF249A;UAS:GFP;HuC:mCherryから、腸管神経系の発生段階におけるセロトニン神経の分化を確認し、セロトニン神経は発生初期に有意に増加することを確認した。また、機能解析に関しては、SONY SI8000セルモーションシステムによる蠕動解析システムを構築した。生きた個体での解析が可能な本システムに、収縮ベクトル別に解析することで、蠕動評価を行う新たなパラメーターを算出した。それによると、発生初期にみられる順蠕動および逆蠕動は、それぞれ異なる収縮ベクトルで形成されていることがわかり、輪走筋および縦走筋の特徴を反映していた。選択的HCNチャネル阻害剤によるセロトニン神経活動を抑制した実験と、光遺伝学を用いたトランスジェニックモデルgSAIGFF249A;UAS:ChRWR-YFPによるセロトニン神経を選択的に興奮させた実験を、SONY SI8000を用いて蠕動解析し、セロトニン神経の役割を調べた。その結果、セロトニン神経による逆蠕動制御メカニズムを解明した。そして、逆蠕動の中でも特に輪走筋の動きを選択的に制御していることがわかった。こちらはサブプロジェクトとして論文をまとめた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CRISPR/Cas9法によりHCN4遺伝子のノックアウトモデルの作成を試みていたが、何らかの理由でguide RNAをinjectionしたキメラの子孫が成魚にまで育たず、ライン化に失敗した。このため研究に遅延が生じたが、現在は購入したHCN4遺伝子のノックアウトモデルを育成中である。今後、このノックアウトモデルを使用してセロトニン神経と腸管神経の発生および保護の関与を検討する。

Strategy for Future Research Activity

発生初期にアンチセンスモルフォリノを使用して一時的にHCN4遺伝子を阻害すると、腸管神経系の発達が阻害され蠕動運動が抑制されることが確認できた。今後はHCN4遺伝子のノックアウトモデルを使用し、HCN4遺伝子そのものが欠落すると腸管蠕動にどのような影響を与えるかを解析する。
また、選択的セロトニン再取り込み阻害薬であるSSRIによっても同様に腸管神経系の発達が阻害された。欧米のコホート研究で行われた妊婦のSSRI内服が、児のヒルシュプルング病の発生に影響するとの報告があり、今後ゼブラフィッシュが胎生期に難治性蠕動不全を誘発する薬剤スクリーニングモデルになり得るか検討していく。

Causes of Carryover

ゼブラフィッシュ成魚の腸管神経系におけるHCN4遺伝子の機能解析を進めるため、HCN4遺伝子のノックアウトモデルを作成・育成する期間が必要であったため、期間延長を行い、研究費を次年度に使用することとした。次年度は機能解析に必要な経費に使用する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Gastrointestinal neurons expressing HCN4 regulate retrograde peristalsis (2020)
  • Author(s): Kensuke Fujii, Koichi Nakajo, Yoshihiro Egashira, Yasuhiro Yamamoto, Kazuya Kitada, Kohei Taniguchi, Masaru Kawai, Hideki Tomiyama, Koichi Kawakami, Kazuhisa Uchiyama, Fumihito Ono
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 30(9) Pages: 2879-2888
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2020.02.024.
  • Peer Reviewed / Open Access