Optimization of the RNAseq analytsis to identify valuable variation of the breast cancer

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08564
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 坂東 裕子 筑波大学, 医学医療系, 准教授 (00400680)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野口 恵美子 筑波大学, 医学医療系, 教授 (40344882)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 乳癌 / 腫瘍特異的変異 / RNAシークエンス / molecular signature

Outline of Annual Research Achievements

近年、患者腫瘍における様々な遺伝子異常に基づいたmolecular signatureが新たな診断の指標となりつつあり、乳癌領域においても、個々の患者に最適な治療法を見出すことが重要となっている。特に予後不良のサブタイプについては、膨大な遺伝子変異情報を基に、化学療法・免疫療法の治療標的となりうる変異を効率よく検出する手法の開発が急務であるが、既存の解析手法で一連の解析を行うのは容易ではない。本研究では、乳癌患者の正常乳腺組織－腫瘍組織のペアサンプルの転写産物をRNAシークエンス（RNA-Seq）により配列決定し、がん特異的変異および、治療標的となりうる変異を効率よく見つけ出す解析手法を確立する。RNA-Seqに基づいた解析では実際に腫瘍組織で発現している変異タンパク質の配列を検出できるほか、融合遺伝子等、治療の標的となりうる分子の同定も1回の解析で明らかにできる。今後、癌の個別化治療法の開発において、免疫療法が有望視されているが、本研究で得られる配列情報には、各患者腫瘍組織におけるネオ抗原候補配列および、その発現量データも含まれる。よって本研究で得られる成果は、新規薬剤標的候補の同定だけでなく、効果的な個別化免疫療法の確立にもつながると考えられる。具体的には以下の項目について研究を行う。
①乳がんの正常-腫瘍ペアサンプルを使用してRNA-Seqによる腫瘍特異的変異の同定法を確立する。
正常乳腺組織・腫瘍組織ペアサンプルのRNA-Seq配列情報をヒトゲノム参照配列にマッピングする。各患者の腫瘍に固有のネオ抗原、融合遺伝子を複数のソフトウェアを用いて探索し、一連の解析方法を最適化する。
②確立した手法で複数検体ペアについて、RNA-Seq 解析を行い、“actionable変異”の同定率をDNAシークエンスから得られた結果と比較し、本研究の解析手法の有用性を検証する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに乳癌7症例（正常各1サンプル、腫瘍部各2サンプル、合計21サンプル）のRNA-seqを行い、複数の体細胞変異検出ソフトウェアを用いて体細胞変異を複数同定した。そのうちの1症例において、正常組織には変異が検出されないが、腫瘍組織で変異頻度の高い体細胞変異を2箇所検出し、サンガー法によるバリデーションにおいても体細胞変異であることが確認された。
ネオアンチゲン探索に関しては、現時点で既に得られているエクソン領域の体細胞変異（非同義置換）のうち発現があるもの（FPKM>5）を候補としてin silicoでネオエピトープ配列の予測を行っている。
融合遺伝子についてはSTAR fusionを用いて探索したが、これらの症例で治療ターゲットとなりうる融合遺伝子は検出されなかった。

Strategy for Future Research Activity

RNA-Seqからの体細胞変異解析を次年度も行うとともに、腫瘍組織のエクソーム解析を行い、RNA-Seqの解析結果と対比させ解析手法をより最適化する。
最適化した解析手法により得られた体細胞変異から、ペプチドワクチンになりうるネオエピトープ配列を予測する。
融合遺伝子についてはTopHat fusion、deFuse、Mapsplice等を用いて再度検索を行う。

Causes of Carryover

RNA-seq にかかる費用として想定していたが、サンプルの調製タイミングにより、シークエンスが4月以降になることより、残額は次年度使用額とすることになった。実験は順調に実施されているがサンプルの取得及び調整にかかる期間のため、年度内執行とならなかった。