Vitro production of natural antibodies using 3D-culture of stroma cells with polymer particles

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08568
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 江口 寛 大阪大学, 医学系研究科, 招へい研究員 (20379267)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 安田 昌弘 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40264808)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 自然抗体産生 / Vitro / ３D / 間質系細胞 / ポリマー粒子

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、ポリマー粒子を用いてstroma細胞を３Dに構築し、その構造内でB１細胞の前駆細胞を長期間維持することにより、Vitroでの自然抗体産生系の確立を目的としている。近年自然抗体は、感染の初期防御や移植だけでなく、自己免疫疾患、癌、動脈硬化症など、各種病態に深く関わることが明らかとなっている。この系の確立により、自然抗体産生機序、特にpositive & negative selectionの機構、およびターゲット抗原特異的、非特異的自然抗体産生方法について、多くの知見が得られるとともに、将来的な疾患治療への応用の可能性について検討されることが期待されている。
初年度の今回は、まずターゲット非依存性の自然抗体産生系の確立が試みられた。初めにstroma細胞（TSt-4)を各種ポリマー粒子を用いて３Dに構築し、Vitroでどれぐらい長期に３D構造が維持可能か検討したところ、最長１６週まで安定した３D構造が維持できることが明らかとなった。次に、培養液中の微量IgMの測定を試みたが、まず高感度Western blotting法において、培養液の組成、ブロッキング方法、抗体ラベル法の各種改変を行い、感度の増強を試みたところ、最高0.1ng(IgMタンパク量）まで定量的解析が可能となった。一方、３D stroma細胞中のB１前駆細胞の同定目的にて、各種蛍光色素でラベルした抗体を用い、培養状態を継続維持したままconfocal microscopyにて検討したところ、PE/Cy5-anti mouse CD19にて良好な染色画像が得られ、経時的なB１前駆細胞の培養状態下での同定が可能となった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

高感度Western blotting法の確立が困難であったため、予定以上に時間が費やされ、産生された抗体の機能検証（Cell killing assayなど）まで、実験が進まなかった。

Strategy for Future Research Activity

ようやく方法論が確立できたので、2年目以降は順調に計画を進められると思われる。

Causes of Carryover

予定していた抗体機能検証実験に着手できなかったため、その分の費用が残った。当該実験は次年度に実施し、翌年度予定分は特に変更なく実施する。