2019 Fiscal Year Research-status Report
ドナー特異的抗体（DSA）制御に向けたHLA産生B細胞への多角的アプローチ
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18K08584
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
野田 貴幸 愛知医科大学, その他部局等, 薬剤師 (50817088)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 孝彰 愛知医科大学, 医学部, 教授 (70314010)
岩崎 研太 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (10508881)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ヒト化マウス / DSA / バイオマーカー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では免疫抑制剤の薬効評価などをはじめとする、慢性抗体関連型拒絶反応の対策を研究する動物実験モデルとして、DSA抗体産生ヒト化マウスモデルの開発を行っている。
免疫不全マウスを用いて、健常人PBMCを尾静脈より移入し作製した。HLA型の異なる健常人PBMCで感作したところ、全例でヒトIgG抗体が検出され、さらにHLA抗体も数例で検出された。その一部はDSAであったが、多くはnonDSAであった。しかし、複数回、検討したが再現性が安定しなかった。間葉系幹細胞の研究では、静脈から投与された細胞の多くは、肺にて捕捉されることが報告されており、本事例においても同様の事が考えられた。また、HLA抗体はアリルの種も多く、産生量も少ないことが予想されたため、特定のタンパク質を抗原に設定し、抗原特異的抗体の検出を開始した。糖鎖抗原としてブタ大動脈内皮細胞（PAEC）を、タンパク抗原として卵白由来のリゾチームを設定し、投与方法、感作するタイミングを変更し、ヒト免疫細胞への生着及び抗原特異的抗体の産生への影響を検討した。まず、投与方法であるが、脾臓内投与および腹腔内投与を行い、これまでの静脈内投与と比較したところ、両投与法とも、静脈内投与時よりも少ないヒト細胞数で生着がみられ、生着期間も腹腔内投与が最も早かった。そのため、現在、腹腔内投与にて実験を進めている。抗原特異的抗体の検出は、これまでのヒトPBMCの生着を確認した後、感作を複数回行うよりも、PBMCとPAECあるいはリゾチームを同時に投与したほうが抗原特異的抗体が、より多く検出されることをELISAにて確認できた。これらは、ヒトPBMC中の抗原提示細胞の存在が関与している可能性があると考え、今後はin vitroにて共培養した後に投与する方法にて、抗原特異的抗体産生の有無を確認していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
DSA産生ヒト化マウスの作製においては投与方法、検出系の見直しを行ったため、当初の計画より少し時間がかかったが、投与方法を変更したことにより、投与細胞の低減に成功しており、また、抗原を投与する時期が抗体産生量を左右することを見出した。現在、ヒトPBMC中の抗原提示細胞の解析を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
数例においてDSAを産生するヒト化マウスの作製に成功した。しかし、その再現性が安定しなかった。その理由としては、マウス体内でのヒト抗原提示細胞の減衰、免疫細胞の成熟に重要な役割を果たす微小環境はマウスに依存していることが考えられるため、抗原提示細胞を含むヒトPBMCと抗原をあらかじめ培養を行い、マウス内へ移入する方法を計画している。さらに、マウス体内ではヒトサイトカインの欠如しているため、培養中に免疫細胞分化を促進するヒトIL-4やIL-21の添加を行い抗原認識能を高める。
また、抗原提示細胞を投与しても目的とする組織に到達する効率が極めて低いとの報告もあることから、抗原提示細胞内に抗原タンパクを移入する方法も模索し、最終的には抗原にドナーPBMCを用い、マウス体内の抗体産生細胞の同定を行っていく予定である。
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| Causes of Carryover |
抗原提示細胞培養に必要な培養液に加える各種サイトカイン、またヒト化マウス作製に必要な免疫不全マウスの購入、飼育に必要な食餌、特定細胞を分離する磁気ビーズ、細胞分化を検出するFlow cytometry に用いる蛍光標識された抗CD38、CD14抗体、IgG抗体の検出（ELISA）、血清中のHLA抗体特異性検査（Single antigen beads）の試薬購入費に充当し、精力的に検体の解析を進めていく予定である。
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