Development of a direct reprogramming method from venous endothelial cells to lymphatic endothelial cells

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K08586
• Research Institution: Asahikawa Medical College
• Principal Investigator: 平田 哲 旭川医科大学, 大学病院, 教授 (80199067)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 齊藤 幸裕 旭川医科大学, 医学部, 准教授 (80540583)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ダイレクト・リプログラミング / リンパ管 / 再生医療

Outline of Annual Research Achievements

静脈系内皮細胞とリンパ管内皮細胞の遺伝子発現の差異を明らかにするため、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト伏在静脈内皮細胞（HSaVEC）およびヒト皮膚リンパ管内皮細胞（HDLEC）の3細胞培養系からmRNAを抽出（QIAGEN社RNeasy Plus Mini Kit使用）しcDNA化（Roche社Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit使用）した後、real time PCR（Roche社LightCycler96システム使用）で評価した。使用したプローブは過去の文献よりリンパ管の形成に重要と思われる9遺伝子とした。その結果、Prox1、VEGFR-3、LYVE-1、ANGPT2の4遺伝子についてHDLECが他の2細胞よりも高発現していた。この結果からリンパ管内皮細胞のマスター遺伝子とされるProx1およびリンパ管新生に必須とされるVEGF-Cの受容体VEGFR-3の2遺伝子の発現を上昇させることで静脈系内皮細胞をリンパ管内皮細胞へと誘導可能なのではないかと仮設を立てた。LYVE-1およびANGPT2はリンパ管誘導のマーカーとして利用することとした。はじめにProx1とVEGFR-3の過剰発現ベクターを作成した（ThermoFisher SCIENTIFIC社pcDNA3.1 (+) Mammalian Expression Vector使用）。これら細胞をHSaVECに遺伝子共導入したところProx1（1164倍、p<0.05 vs control、Day1）、VEGFR-3（946倍、p<0.01 vs control、Day3）ともに過剰発現されていることを確認した。しかしLYVE-1とANGPT2はDay5まで上昇を認めずHSaVECをLECに誘導することはできていなかった。