2018 Fiscal Year Research-status Report
Searching for new diagnostic markers for Hirschsprung disease using tissue clearing methods
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18K08601
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
宮原 克 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 技術員 (00420844)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 なほ 順天堂大学, 医学部, 非常勤講師 (20589543)
山高 篤行 順天堂大学, 医学部, 教授 (40200703)
田中 奈々 順天堂大学, 医学部, 准教授 (50530656)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 腸管神経系 / ヒルシュスプルング病 / 組織透明化 / モデルマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸管神経系は胎生期において後脳から発生した神経堤細胞が前腸に侵入し分化増殖しながら尾側へと遊走し、一部の大腸末梢領域を除いた消化管全域を支配し形成される。しかしヒルシュスプルング病（H病）の腸管神経系の発生過程では、無神経節部で著しく外来神経線維が増生することが知られている。今年度においては腸管神経系イメージングモデルマウス胎児を用いて透明化組織イメージング法を行い、H病において増生する外来神経線維がどのように正常発生と異なっているかを解剖学的に明らかにするために、組織透明化法による神経支配の可視化を試みた。
腸管神経細胞の遊走に関連する遺伝子でH病原因遺伝子でもあるエンドセリンレセプターBノックアウトマウスと、腸管神経堤細胞マーカーであるSox10遺伝子に緑色蛍光タンパクを標識したマウスを交配し、腸管神経系が強い蛍光を発するH病モデルを作製し、このマウスの胎児（胎生10日・15日）を用いた透明化のステップに進んだ。今回の検討では組織の伸縮がなく蛍光タンパクが退色せず、また操作の簡便さに重点をおき、SeeDB法を採用した。観察は共焦点顕微鏡により2mm程度の厚さで、タイリングイメージングによる広い視野での骨盤・仙骨由来の外来神経と発生中の腸管神経の位置関係が明瞭に可視化できるように撮影方法を工夫した。得られた画像を三次元画像処理ソフトにて立体構築処理を行い直腸肛門部の神経発生変化を観察したところ、正常発生マウスに比べ過剰に発生する外来神経線維がH病モデルマウスで観察することができた。
透明化法によるイメージングによりこれまで観察が不可能であった深部での腸管と外部神経叢との関係を明瞭にすることができた。現在、得られた画像をもとにH病で増生する神経の発生がどのように進行していくか確認し、また腸管とその周囲組織におけるいくつかの分子との関連を免疫染色で観察している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マウス胎児の組織透明化で得られた画像で腸管に入る神経分布の詳細が同定できていない。また組織透明化を行うことによる利点を活かした画像撮影法の調整に時間を必要とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた画像での本疾患特有の異常な神経分布を解剖学的に正常との違いを正確に明らかにし、神経発生を専門とする研究者からの助言を求め、異常神経支配にかかわる病理学的に有用な分子を絞り込む。モデルマウスの安定した供給のため、専門の実験介助者にマウス交配と遺伝子検査を一任する。
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| Causes of Carryover |
年度末に購入予定の文具が必要なくなったため
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