Impact of intraperitoneal tumor microenvironment on peritoneal dissemination of gastric cancer via involvement of extracellular vesicles

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08679
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 香川 俊輔 岡山大学, 大学病院, 准教授 (00362971)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉田 龍一 岡山大学, 大学病院, 助教 (80534768)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 胃癌 / 癌微小環境 / マクロファージ / IL-6 / 細胞外小胞体

Outline of Annual Research Achievements

１．胃癌患者の腹腔内微小環境の分析のため研究同意が得られた胃癌患者から採取した腹腔洗浄液の細胞成分を回収し、癌細胞標識に加え各種抗体等を用い細胞免疫染色を施行し、Flow cytometryによって細胞成分解析を行ったところ、胃癌が播種している腹腔内にはM2マクロファージの割合が高いことが確認された。実験用マクロファージとして末梢血単核球、単球細胞株からマクロファージを分化誘導する手法を確立した。M2マクロファージの胃癌細胞に及ぼす影響の解析したところ、共培養によって胃癌細胞の遊走能、浸潤能が亢進した。化学療法感受性への影響に関しては、化学療法に対しより抵抗性を示す傾向がみられたが、有意差はなかった。上記のマクロファージの胃癌への作用に介在する媒体を解明するため、マクロファージと胃癌細胞の培養上清中の作用伝達物質の探索を行った。共培養上清をarrayを用いてを探索したところ、癌細胞共培養上清中にIL-6が有意に高い濃度で検出された。腹腔洗浄液中でもIL-6を解析したところ、腹膜播種を有する症例で有意にIL-6濃度が高いことが確認された。IL-6あるいは抗IL-6中和抗体を用いた動物実験ではIL-6の投与でマウスでの胃癌腹膜播種の増大が促進され、一方、抗IL-6抗体で腹膜播種が抑制される傾向が観察された。
２．胃癌細胞培養上清、並びに臨床での腹腔洗浄液検体からの細胞外小胞体（EVs）の抽出を行った。EVsマーカーのCD9、CD63 、CD81の蛋白発現分析、及び粒子径分析器による抽出粒子径を分析したところ、胃癌細胞培養上清、腹腔洗浄液からEVsでは特異的マーカーの発現が確認され、粒子径も100nm程度のEVsが採取されていることが確認された。癌細胞由来のEVsをPKH26蛍光色素でマーキングした上で、マクロファージに添加すると、マクロファージに取り込まれることが確認された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、腹腔内の微小環境におけるマクロファージの役割がある程度明らかにできた。胃癌細胞株での実験でも臨床検体を用いた実験でも同様の結果が得られ、実験データの再現性も確認できている。IL-6という重要な因子も見つかった。EVsの採取、分析も可能な実験手技が整備でき、胃癌とマクロファージに介在する媒体としてのEVsの役割を分析する基盤も確立できた。

Strategy for Future Research Activity

腹腔内の癌微小環境のさらなる分析を進める。癌細胞とマクロファージとの相互作用を媒介する因子としてEVsの作用の分析を進める。具体的には癌細胞からのEVsがマクロファージの分化にどのように関与しているかを、種々の状態に分化させた単球、マクロファージに癌細胞由来のEVsを作用させ、マクロファージの分化状態の変化を詳細に調査する。腹腔内癌微小環境におけるIL-6の関与に関しても、より多くの臨床検体で解析を進め、その臨床病理学的因子との関係を探る。

Research Products

• [Journal Article] The epithelial-to-mesenchymal transition induced by tumor-associated macrophages confers chemoresistance in peritoneally disseminated pancreatic cancer (2018)
  • Author(s): Kuwada Kazuya、Kagawa Shunsuke、Yoshida Ryuichi、Sakamoto Shuichi、Ito Atene、Watanabe Megumi、Ieda Takeshi、Kuroda Shinji、Kikuchi Satoru、Tazawa Hiroshi、Fujiwara Toshiyoshi
  • Journal Title: Journal of Experimental & Clinical Cancer Research Volume: 37 Pages: 307
  • DOI: 10.1186/s13046-018-0981-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Integrated fluorescent cytology with nano-biologics in peritoneally disseminated gastric cancer (2018)
  • Author(s): Watanabe Megumi、Kagawa Shunsuke、Kuwada Kazuya、Hashimoto Yuuri、Shigeyasu Kunitoshi、Ishida Michihiro、Sakamoto Shuichi、Ito Atene、Kikuchi Satoru、Kuroda Shinji、Kishimoto Hiroyuki、Tomida Shuta、Yoshida Ryuichi、Tazawa Hiroshi、Urata Yasuo、Fujiwara Toshiyoshi
  • Journal Title: Cancer Science Volume: 109 Pages: 3263～3271
  • DOI: 10.1111/cas.13760
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Extracellular vesicles in the ascites from gastric cancer patients play critical roles to promote peritoneal dissemination in the intraperitoneal cancer microenvironment (2018)
  • Author(s): Atene Ito, shunsuke kagawa, Shuichi Sakamoto, Kazuya Kuwada, Satoru Kikuchi, Shinji Kuroda, Ryuichi Yoshida, Hiroshi Tazawa and Toshiyoshi Fujiwara
  • Organizer: AACR Annual Meeting 2018
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] IL6 derived from intraperitoneal macrophages is involved in peritoneal dissemination of gastric cancer (2018)
  • Author(s): Shunsuke Kagawa, Shuichi Sakamoto, Kazuya Kuwada, Atene Ito, Hiroki Kajioka, Shinji Kuroda, Satoru Kikuchi, Ryuichi Yoshida, Hiroshi Tazawa, Toshiyoshi Fujiwara
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会
• [Presentation] Extracellular vesicles from gastric cancer promote peritoneal dissemination via M2 differentiation of macrophages. (2018)
  • Author(s): Atene Ito, Shunsuke Kagawa, Hiroki Kajioka, Shuichi Sakamoto, Kazuya Kuwada, Satoru Kikuchi, Shinji Kuroda, Masahiko Nishizaki, Ryuichi Yoshida, Hiroshi Tazawa, Toshiyoshi Fujiwara
  • Organizer: 第77回日本癌学会学術総会