2018 Fiscal Year Research-status Report
New strategy of hepatocellular carcinoma treatment using exosomes exocrimned by cancer associated fibroblast
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18K08707
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
原田 昇 九州大学, 大学病院, 講師 (80419580)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
間野 洋平 九州大学, 大学病院, 助教 (10792244)
副島 雄二 九州大学, 大学病院, 准教授 (30325526)
戸島 剛男 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (40608965) [Withdrawn]
本村 貴志 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (50719507)
吉住 朋晴 九州大学, 医学研究院, 准教授 (80363373)
池上 徹 九州大学, 大学病院, 講師 (80432938)
伊藤 心二 九州大学, 大学病院, 助教 (90382423)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 癌関連線維芽細胞 / CAF / エクソソーム / Normal fibroblast / マイクロアレイ解析 / miRNA / EMT / 網羅的解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌進展に重要な癌関連線維芽細胞（Cancer associated fibroblast; CAF）が分泌するエクソソームと呼ばれる細胞外小胞は多種多様の未知のタンパクやmRNAやmiRNA等を内包するが、その詳細な機能的意義については未解明である。CAFがエクソソームを介して癌細胞の上皮間葉転換をもたらし、癌の増殖浸潤の重要な役割を担っている可能性があり、この機序解明は新規肝癌増殖浸潤を制御した革新的治療法に繋がると考えた。本研究の目的は肝癌におけるCAFのエクソソームを介した癌増殖浸潤機序を解明し、新規肝癌治療を創案することである。
１）当該年度では肝細胞癌患者（6検者）の癌部・非癌部より線維芽細胞を分離・培養し培養液中のエクソソームをまずは十分量抽出することに成功した。２）抽出されたエクソソーム添加による、肝癌細胞株 (Huh7, Hep3B)における増殖・浸潤・EMTの変化を比較したが、エクソソーム添加群では肝癌細胞株の増殖、浸潤、EMTを確認し、Normal fibroblast(NF)、CAF上清からexosomeを取り除いた上清では癌進展が抑制されていた。３）1)で得られたエクソソームをアレイ解析を用いて発現変化のmiRNAXを検索し、単離した線維芽細胞より抽出したexosomal miRNAを網羅的に解析した。結果としてCAF-exosomeであるmiRRNA発現が有意に低かった。４）肝癌患者の血清中に含まれるエクソソームを抽出し、3)で得られたmiRNAが健常人の血清中のエクソソームと比較して増減の有無を確認したところ、NFと比較してCAFでのmiRNAX発現が低く、また各種肝癌細胞株でも同等ないし低下していた。以上よりCAFでmiRRNAXの発現の低下が、癌進展機序に関与していることを証明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題の進捗は概ね進展していると考えます。研究計画書に示していました平成30年から31年の内容に当たるエクソソーム（癌部・非癌部から抽出した）に対してマイクロアレイ解析施行し、発現変化のあるタンパクやmiRNAやmRNAを検索、電子顕微鏡又はNanosightで50-150nmの粒子確認しました。また各種assayに必要なexosome量を検討し、その量を決定し、RNA isolation KitでRNAを抽出、品質チェックしマイクロアレイ解析しました。さらにマイクロアレイで増減が確認されたタンパクやmiRNAやmRNAを実際のエクソソームで確認するといった項目は全て施行することができております。結果としてCAF-exosomeでmiRRNAX発現が有意に低かったことをさらに示すことが可能となったためです。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後については、当該年度計画書にありますように令和1年（平成32年度）分の課題として１）MiRRNAXを強制発現させたCAFs由来のexosomeで、miRRNAX強制発現していることを確認し、癌細胞株に添加すること。２）RNAを選択的に染色するSYTO RNASelect（緑色蛍光細胞色素）を、抽出したexosomeに反応させ、癌細胞株に添加し観察すること。３）MiRRNAXを強制発現させたCAFの放出するexosomeで癌進展が抑制されることを確認すること。最後に４）８５種類の遺伝子からmiRRNAXと負の相関のある遺伝子を特定することを目指して進める予定であります。さらにその遺伝子の臨床検体での発現を確認し、生存率、無再発生存率を確認します。これらの結果を集積し、論文化を行なっていきます。
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