2019 Fiscal Year Research-status Report
原子間力顕微鏡を用いた血管の「硬さ」測定による動脈硬化病変の評価法の確立
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18K08729
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
松尾 映里 三重大学, 医学部附属病院, 技術補佐員 (40751665)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
島本 亮 三重大学, 医学部附属病院, 准教授 (90324524)
岡本 貴行 島根大学, 学術研究院医学・看護学系, 准教授 (30378286)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 動脈硬化 / 血管内皮細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究においては、動脈硬化における内皮細胞の機能に及ぼす微小環境の力学的性質（硬さ）の影響を分子生物学的に検討するため、血管内皮細胞を硬さの異なる細胞外基質において培養し、基質の硬さにより細胞機能の制御に影響を与えるか検討しました。
今回は、ヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、内皮細胞刺激因子を添加しました。内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、内皮細胞刺激因子の添加有無の各細胞から、mRNAを抽出し、血管新生に関わる遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにて解析しました。内皮細胞刺激因子添加の有無両方の条件で、Delta-like protein 4 （Dll4）が硬さに比例して発現が減少することを確認できました。また、同じ硬さで比べた場合、内皮細胞刺激因子添加により、発現量は多い傾向が確認できました。そこで、同様に培養した細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロッティングにて解析した結果、ｍRNAと同様の発現の傾向を示しました。さらに受容体であるNotchのタンパク量も、硬さに比例して発現が減少する傾向にあり、Notchがリガンド結合することにより生成されるNICDの発現量も同様の傾向であることが確認できました。また、動脈硬化に関わる遺伝子28種類についてリアルタイムPCRにて解析しました。Dll4以外にも硬さにより影響を受ける遺伝子が確認できました。血管組織の硬さは、血管内皮細胞の増殖や分化に影響を与えることを明らかにしました。基質の硬さが、細胞機能の制御に影響を与える可能性を示しました。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究においては、動脈硬化における内皮細胞の機能に及ぼす微小環境の力学的性質（硬さ）の影響を分子生物学的に検討するため、血管内皮細胞を硬さの異なる細胞外基質において培養し、基質の硬さにより細胞機能の制御に影響を与えるか検討しました。
ヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、内皮細胞刺激因子を添加しました。内皮細胞刺激因子の添加濃度、添加後の培養時間等を検討し、内皮細胞刺激因子の添加有無の各細胞から、mRNAを抽出し、血管新生に関わる遺伝子の発現量をリアルタイムPCRにて解析しました。内皮細胞刺激因子添加の有無両方の条件で、Delta-like protein 4 （Dll4）が硬さに比例して発現が減少することを確認できました。また、同じ硬さで比べた場合、内皮細胞刺激因子添加により、発現量は多い傾向が確認できました。そこで、同様に培養した細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロッティングにて解析した結果、ｍRNAと同様の発現の傾向を示した。さらに受容体であるNotchのタンパク量も、硬さに比例して発現が減少する傾向にあり、Notchがリガンド結合することにより生成されるNICDの発現量も同様の傾向であることが確認できました。
また、動脈硬化に関わる遺伝子28種類についてリアルタイムPCRにて解析しました。Dll4以外にも硬さにより影響を受ける遺伝子が多く確認され、予測していた以上の成果が得られました。血管組織の硬さは、血管内皮細胞の増殖や分化に影響を与えることを明らかにしました。基質の硬さにより細胞機能の制御に影響を与える可能性を示すことが確認できました。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回硬さにより発現量が低下したDll4がをヒト臍帯静脈内皮細胞を1,2,4,8,25kPaの硬さの異なるコラーゲンコートしたポリアクリルアミドゲルシャーレ上で培養し、Delta-like protein 4 （Dll4）が硬さに比例して発現が減少することを確認できました。また、同じ硬さで比べた場合、内皮細胞刺激因子添加により、発現量は多い傾向が確認できました。そこで、同様に培養した細胞からタンパクを抽出し、ウェスタンブロッティングにて解析した結果、ｍRNAと同様の発現の傾向を示した。さらに受容体であるNotchのタンパク量も、硬さに比例して発現が減少する傾向にあり、Notchがリガンド結合することにより生成されるNICDの発現量も同様の傾向であることが確認できました。
また、動脈硬化に関わる遺伝子28種類についてリアルタイムPCRにて解析しました。Dll4以外にも硬さにより影響を受ける遺伝子が多く確認されました。
そこで、Dll4の発現をSiRNAによって抑制することで、Notchシグナルやll4以外の硬さにより影響を受けた遺伝子の発現量についてどのような影響を受けることになるのか検討します。
また、近年、細胞外基質の硬度や細胞形態に応じて、ヒト上皮細胞等でYAP/TAZの活性状態が変化することが確認されており、YAP/TAZのリン酸化・活性化を通じて、細胞増殖を制御することが明らかになってきています。
そこで、今回の実験についてYAP/TAZの発現量も分析し、今回細胞外基質の硬度により発現量の変化した遺伝子について、YAP/TAZの活性化阻害、核移行阻害による発現量の変化を検討します。
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| Causes of Carryover |
実験試薬が、安く入手できたため。
実験試薬の購入に、使用する予定。
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