Development of a novel drug therapy for cardiac remodeling focusing on the activity of GSK-3 and autophagy

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K08762
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 帯刀 英樹 九州大学, 医学研究院, 講師 (40343321)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 心臓リモデリング / 心筋肥大 / オートファジー / イソプロテレノール / ジメチルセレコキシブ

Outline of Annual Research Achievements

平成30年度はジメチルセレコキシブ(DMC)の心筋リモデリングに対する効果をin vivo実験にて検証した。
C57BL/6マウスに対し、osmotic-pumpを用いて非選択的β受容体刺激薬であるイソプロテレノール(ISO)を持続皮下投与した(20mg/kg/day, 2週間)。治療薬であるDMCは同期間エサに混合(1000ppm)して経口摂取させた。2週間後に安楽死させ、心臓を摘出し評価を行った。Control群、ISO群、ISO+DMC群で比較を行った。
ISO投与により、心拍数と収縮期血圧が有意に上昇した。ISO心重量が有意に増大したが、DMCはこれを抑制する傾向を示した。組織評価にて、ISOは心筋細胞断面積を有意に増大させたが、DMCはこれを有意に抑制した。また、DMCはISOにより誘導された左室線維化を有意に抑制した。これらにより、ISO投与により誘導された心臓リモデリング(心筋肥大、心臓線維化)をDMCが抑制することが示唆された。
続いて上記の機序について検討を行った。Western blottingによりISO投与によりAktおよびGSK-3βのリン酸化の割合が有意に増加したが、DMCはこれを有意に抑制させた。GSK-3は心筋肥大を抑制する因子と言われている。従ってDMCはAkt阻害によりGSK-3を活性化することで心筋肥大を抑制していることが示唆された。
オートファジーとの関与については、重要なマーカーであるLC-3を中心に検証を行っているところである。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ISO投与により、心臓リモデリング(心筋細胞肥大、心臓線維化）が誘導され、DMCがそれを抑制することが確認されたことから、仮説通りの結果を得ることができた。さらにDMCによるAkt阻害とそれに続くGSK-3β活性化が確認でき、DMCの効果における重要な機序であると考えられた。
これらの効果とオートファジーとの関与を検証しているが、重要なマーカーであるLC-3の検出がwestern blottingにて十分にできていない状況である。LC-3は低分子タンパクであるため、条件が適切に設定できていない可能性が考えられる。

Strategy for Future Research Activity

Western blottingによりLC-3の変化を適切に捉えられる様に、ゲル組成やバッファー、転写時間、メンブレンの条件を再検討する。また、western blottingのみではなく、免疫蛍光染色を用いて変化を捉えることができないか検討する。さらにその他のマーカーであるBeclin-1、p62、mTOR等についても検証を行っていく。

Causes of Carryover

当初、オートファジーのマーカーであるLC-3、Beclin-1、p62、mTOR等の抗体を購入し実験を行う予定であったが、最も重要なLC-3の検出に時間を要しているため、それ以外のマーカータンパクの検証に移行できておらず、試薬購入も延期している状況である。今後はLC-3の蛍光染色を行うための試薬、LC-3以外のオートファジーマーカー検出に必要な抗体等の試薬購入に充てたいと考えている。